HPLC法同时测定参麦注射液中9种人参皂苷

2019-06-03王若柳范骁辉张金华王书芳

中成药 2019年5期

王若柳，范骁辉，袁玮，张金华，王书芳∗

（1.浙江大学药学院，浙江杭州 310058；2.大理药业股份有限公司，云南大理 671000）

参麦注射液是国家基本药物目录收载的常用复方中药注射液，由红参、麦冬2 味药材制成，具有养阴生津、益气固脱、生脉等功效，具有抗心率失常［1］、抗炎［2］、抗肿瘤［3］等作用，临床上用于治疗冠心病［4］、心力衰竭［5］、休克［6］等。人参皂苷是参麦注射液中主要活性成分，如人参皂苷Rg1具有延缓衰老［7］、抗脑缺血再灌注损伤作用［8］；人参皂苷 Re 具有抗缺血性心律失常、抗氧化、镇静、抗利尿作用［9］；人参皂苷 Rf 具有抗疲劳作用；人参皂苷Rb1对中枢神经系统、心血管系统、免疫系统均具有保护作用［10］；人参皂苷Rc 具有抗血小板聚集作用［11］；人参皂苷 Ro 具有抗胃癌作用［12］；人参皂苷Rb2、Rb3对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用［13］；人参皂苷 Rd 具有抗癌［12］、神经保护作用［14］。

然而，在国家食品药品监督管理局颁布的质量标准中，仅对参麦注射液中总皂苷及红参中人参皂苷 Rg1、Re、Rb1含有量测定提出了要求［15］，难以全面控制其质量；相关文献大多也只对其中少数人参皂苷含有量进行了测定［16-20］；曹树萍等［21］建立HPLC 法测定其中9种人参皂苷的含有量，但未涉及到人参皂苷 Ro、Rb3。因此，本实验建立 HPLC法同时测定参麦注射液中9种人参皂苷（人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd）的含有量，为该制剂质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配置四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ChemStation 工作站控制系统；AE240 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超纯水器（美国Millipore 公司）。

1.2 试药参麦注射液由大理药业股份有限公司提供，人参皂苷 Rg1（批号 151103）、Re（批号151129 ）、Rf（批号 150922 ）、Rb1（批号1609320）、Rb2（批号 151026 ）、Rb3（批号151127）、Rd（批号161007）、Rc（批号151102）、Ro（批号150929）对照品均购自上海融禾医药科技发展有限公司。磷酸为色谱纯（美国 Tedia 公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（德国 Merck 公司）；去离子水由Milli-Q 超纯水系统过滤得到。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd对照品适量，置于量瓶中，50% 甲醇制成每 1 mL 分别含 Rg10.095 4 mg、Re 0.102 6 mg、Rf 0.036 0 mg、Rb10.182 4 mg、Rc 0.082 5 mg、Ro 0.098 0 mg、Rb20.109 8 mg、Rb30.030 2 mg、Rd 0.090 8 mg 的贮备液，精密量取适量，50%甲醇稀释，即得。

2.1.2 供试品溶液精密移取注射液1 mL 于2 mL量瓶中，甲醇定容至 2 mL，混匀，即得。

2.2 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.05%磷酸）（B），梯度洗脱（0 min，18%A；35 min，20%A；40 min，21% A；42 min，26% A；70 min，26%A；85 min，30%A；100 min，34%A；101 min，100% A；110 min，100% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温 26 ℃；检测波长 203 nm；进样量 20 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性实验精密吸取对照品、供试品溶液各20 μL，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1，可知待测成分与杂质峰之间可达到基线分离。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察取 “2.1.1”项下对照品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积（Y）对溶液质量浓度（X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验将对照品溶液在 “2.2”项色谱条件下进样测定 6 次，测得人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 峰面积RSD 分别为 1.6%、0.7%、1.8%、0.8%、0.7%、0.5%、0.9%、1.0%、0.8%，表明仪器精密度良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重复性试验同一操作人员在同一时间内按 “2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 含有量 RSD 分别为 1.5%、2.3%、2.5%、1.0%、1.4% 、2.2% 、1.4% 、3.6% 、1.8% 。然后，同一操作人员在不同时间内按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，测得 9种人参皂苷含有量 RSD 分别为 2.5%、3.8% 、3.4% 、2.6% 、2.7% 、4.4% 、2.5% 、3.7%、3.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置 0、4、8、12、16、20、24 h 后在 “2.2”项色谱条件下进样测定，测得人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 峰面积 RSD 分别为2.1% 、2.1% 、0.7% 、2.8% 、3.7% 、2.9% 、3.2% 、2.4% 、3.3% ，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密量取含有量已知的注射液适量，按照9种人参皂苷含有量约75%、100%、125%的水平精密加入对照品溶液，每个水平平行3 份，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 平均加样回收率分别为99.1% 、97.6% 、96.7% 、98.6% 、102.2% 、100.3%、98.8%、102.3%、97.4%，RSD 分别为3.1% 、4.3% 、4.3% 、3.3% 、2.3% 、2.9% 、3.6% 、4.4% 、3.7% 。

2.4 样品含有量测定按 “2.1.2”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在 “2.2”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 讨论

3.1 流动相选择本实验比较了乙腈-0.05% 甲酸、乙腈-水、乙腈-水（含 0.05% 磷酸）［22］，发现加入甲酸后基线漂移严重，其原因可能为甲酸在203 nm 波长处存在末端吸收；乙腈-水加入0.05%磷酸后人参皂苷 Rg1、Re 分离效果较好，故选择乙腈-水（含0.05%磷酸）作为流动相。

3.2 柱温选择本实验比较了26、28、30 ℃时的色谱图，发现26 ℃时人参皂苷Rc 与杂质峰分离较好，故选择其作为柱温。

3.3 洗脱梯度选择本实验在文献［22］的基础上，对洗脱梯度进行了优化。人参皂苷 Rg1、Re极性相近，分离困难，故采用18% 乙腈作为起始比例，再缓慢上升至20%，能较好地分离两者；人参皂苷Rc、Ro 之间存在杂质峰，故增加一段等度洗脱（42～70 min，26%乙腈），发现杂质峰与2种人参皂苷的分离度理想。