HPLC法同时测定宝儿康散中9种成分

2019-06-03邢晓红姚韧辉李春钢

中成药 2019年5期

邢晓红，张静，董卓，姚韧辉，李春钢∗

（1.唐山职业技术学院儿科教研室，河北唐山 063000；2.唐山职业技术学院药剂教研室，河北唐山 063000）

宝儿康散收载于卫生部颁药品标准中药成方制剂第十册（标准编号WS3-B-1966-95），由太子参、白术（炒）、茯苓、石菖蒲、芡实、北沙参、山药、陈皮等14 味药材加工而成，主要用于小儿脾胃虚弱、消化不良、食欲不振、大便异常、精神困倦、睡眠不安、夜惊、夜啼等病症的治疗［1］，对小儿急性腹泻、小儿慢性迁延性腹泻、小儿营养性缺铁性贫血、婴幼儿非感染性腹泻疗效显著，而且临床应用安全［2-7］。方中太子参、炒白术、山药、北沙参补气健脾、益气养阴，为主药，辅以茯苓、白扁豆、芡实健脾化湿，薏苡仁、陈皮和胃调中，石菖蒲、莲子化湿和胃、开胃进食、安神定惊，山楂、麦芽消食健胃，炙甘草调和诸药，诸药共奏，以达补气健脾、开胃消食、渗湿、止泻之功效［6］。

宝儿康散为中成药复方制剂，成分复杂，现行质量标准未对方中任何药材进行定量测定研究，仅检索到对其中橙皮苷含有量进行测定的报道［8-10］，但单一成分难以有效控制其质量稳定性和疗效一致性。因此，本实验采用HPLC 法同时测定宝儿康散中太子参代表性成分太子参环肽B，白术代表性成分白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ，茯苓代表性成分去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸，石菖蒲代表性成分 β-细辛醚、α-细辛醚的含有量，以期为该制剂质量控制方法的建立提供科学依据。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；AE240 型电子分析天平（十万分之一，瑞士 Mettler-Toledo 公司）；YQ-920A 型超声波清洗器（上海易净超声波仪器有限公司）。白术内酯Ⅲ（111978-201501，含有量99.9%）、白术内酯Ⅰ（111975-201501，含有量 99.9%）、β-细辛醚（112018-201601，含有量96.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；太子参环肽B（145459-19-4，含有量98.0%）对照品购自上海广锐生物科技有限公司；去氢土莫酸（6754-16-1，含有量98.0%）、土莫酸（20126-76-5，含有量 98.0%）、去氢茯苓酸（77012-31-84，含有量 98.0%）对照品均购自南京森贝伽生物科技有限公司；茯苓酸（6754-16-1，含有量98.0%）对照品购自上海纯优生物科技有限公司；α-细辛醚（2883-98-9，含有量98.0%）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司。宝儿康散（每瓶装 1 g，批号 B170401、B170501、B180202）购自广东宏兴集团股份有限公司宏兴制药厂。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备精密称取太子参环肽B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、β-细辛醚、α-细辛醚对照品适量，甲醇分别制成 0.372、0.436、0.398、0.792、0.316、0.474、0.952、2.974、2.178 mg／mL 贮备液，各精密量取 2.5 mL，置于 50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液制备取装量差异项下散剂内容物，研成细粉，过80 目筛后精密称取2.0 g，置于25 mL 具塞锥形瓶中，加20 mL 甲醇超声（400 W、40 kHz）提取 30 min，放冷，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液按照散剂处方和工艺，分别制备不含太子参、白术（炒）、茯苓、石菖蒲的阴性样品，按 “2.2”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.05% 磷酸，梯度洗脱（0～12.0 min，40% A；12.0～17.0 min，40%～52% A；17.0～24.0 min，52%～65% A；24.0～35.0 min，65%～87% A；35.0～44.0 min，87%～92% A；44.0～50.0 min，92%～40%A）；0～17.0 min 在 203 nm［11-12］波长下检测太子参环肽 B，17.0～24.0 min 在 220 nm［13-14］波长下检测白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ，24.0～35.0 min 在210 nm［15-16］波长下检测去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸，35.0～50.0 min 在 257 nm［17］波长下检测 β-细辛醚、α-细辛醚；体积流量0.9 mL／min；柱温 35 ℃；进样量 10 μL。

2.5 系统适应性试验精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在 “2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分与相邻峰之间均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计，均不低于3 500。

2.6 线性关系考察精密吸取 “2.1”项下贮备液 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于 6 个20 mL 量瓶中，甲醇制成20 倍质量浓度差的对照品溶液，在 “2.5”项色谱条件下进样测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7 精密度试验取 “2.1”项下对照品溶液，在 “2.5”项色谱条件下进样测定6 次，测得太子参环肽B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、β-细辛醚、α-细辛醚峰面积RSD 分别为1.21%、1.15%、1.06%、0.90% 、1.19% 、1.05%、0.82%、0.55%、0.62% ，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验取同一批（批号B170401）散剂6 份，按 “2.2”项下方法制备 6 份供试品溶液，在 “2.5”项色谱条件下进样测定，测得太子参环肽B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、β-细辛醚、α-细辛醚含有量RSD 分别为1.82%、1.70%、0.73%、1.59% 、1.74% 、0.63% 、1.45% 、1.03% 、0.87% ，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验取同一批（批号B170401）散剂，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下 0、2、4、6、8、12 h 在 “2.5”项色谱条件下进样测定，测得太子参环肽B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、β-细辛醚、α-细辛醚峰面积 RSD 分别为1.15% 、1.09% 、1.10% 、0.86% 、1.17% 、1.08% 、0.85%、0.60%、0.96%，表明供试品溶液在 12 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验取含有量已知的散剂（批号 B170401）6 份，研成细粉，过 80 目筛后每份精密称取1.0 g，置于25 mL 具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（太子参环肽B 0.199 mg／mL、白术内酯Ⅲ 0.257 mg／mL、白术内酯Ⅰ0.213 mg／mL、去氢土莫酸 0.442 mg／mL、土莫酸 0.171 mg／mL、去氢茯苓酸 1.289 mg／mL、茯苓酸 0.531 mg／mL、β-细辛醚 2.174 mg／mL、α-细辛醚 1.441 mg／mL）各1.0 mL，再加入 11 mL 甲醇，超声（400 W、40 kHz）提取 30 min，放冷，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，在 “2.5”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，太子参环肽B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、去氢土莫酸、土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、β-细辛醚、α-细辛醚平均加样回收率分别为 98.11%、99.18%、97.81%、99.85%、96.94% 、97.83% 、98.92% 、100.05%、99.26% ，RSD 分别为 1.01%、1.34%、0.81%、0.59%、1.25% 、0.91% 、1.29% 、0.68% 、1.10% 。

2.11 样品含有量测定取3 批散剂（B170401、B170501、B180202），按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.5”项色谱条件下进样测定，平行3 次，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法筛选本实验比较了甲醇［11-18］、50% 甲醇、乙醇、50% 乙醇，发现以甲醇为提取溶剂时各成分综合提取效率最佳，在此基础上又比较了超声提取［11-18］、回流提取，以及提取时间 15、30、60 min，最终确定甲醇超声提取30 min作为供试品溶液制备方法。

3.2 流动相筛选本实验首先比较了乙腈-水［11-12］、甲醇-水［13-14］，发现以前者为流动相时太子参环肽B、土莫酸、去氢茯苓酸分离效果更理想，但去氢土莫酸、β-细辛醚、茯苓酸分离效果不佳，并存在拖尾现象。然后，又考察了乙腈-0.05% 磷酸［15-16］、乙腈-0.1% 甲酸［17-18］、乙腈-0.1%冰醋酸，发现以乙腈-0.05%磷酸为流动相时分离效果更理想，在此基础上对其洗脱比例进行不断摸索，最终确定 “2.4”项下色谱条件，此时色谱峰基线平稳，峰形对称，各成分均能达到有效分离。