醋制蓬莪术中总姜黄素回流提取工艺的优化

高天慧，陈雯清，陈诗韵，廖 婉，傅超美

（成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137）

蓬莪术Curcuma phaeocaulisVal.为川产道地药材，是2015年版 《中国药典》 收载的莪术主要来源之一，具有行气破血、消积止痛功效，常用于治疗饮食积滞、痞满呃逆等症［1］，经醋制后行气破血之力更胜，而且峻猛药性减缓［2-7］，挥发油、总姜黄素为其主要有效成分，其中前者以吉马酮、莪术烯、莪术酮、莪术醇、β-榄香烯等为代表［8-9］，而后者以双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素等为代表［10］。前期研究发现，蓬莪术对刀豆蛋白A 所致免疫性肝损伤具有良好的保护作用，并且经醋制后利肝抗炎活性增强［11］；姜黄素和双去甲氧基姜黄素是该药材主要药效成分［12］，而且前者含有酚羟基和烯醇式羟基，可阻断氧化反应中自由基链式反应，从而发挥抗氧化自由基作用［13］。本实验通过正交试验结合人工神经网络优化醋制蓬莪术中总姜黄素回流提取工艺，以期为后续该药材炮制机理研究及相关制剂开发奠定基础。

1 材料

电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号CPA225D］；纯水机（优普纯水系统上海分公司，型号 UPK-I-10T）；高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号LC-2030C3D）；旋转蒸发仪（上海泉杰仪器有限公司，型号 OSB-2100）。双去甲氧基姜黄素（CAS号 33171-05-0，批号140613）、去甲氧基姜黄素（CAS号 24939-17-1，批号 140815）、姜黄素（CAS号 458-37-7，批号140612）对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司，含有量均≥98%。蓬莪术采自道地产区四川省，经成都中医药大学中药标本中心蒋桂华教授鉴定为蓬莪术Curcuma phaeocaulisVal.。乙腈为色谱纯（美国Sigma-Aldrich 公司）；冰醋酸（成都市联合化工试剂研究所，批号 201411041）；9°米醋（佛山市海天调味食品股份有限公司，批号20150210）。

2 方法与结果

2.1 醋制蓬莪术制备 采用前期专利（公开号CN103463567A）报道的方法［14］，取适量生品，加入9°米醋（用量30%）拌匀闷润2 h，煮至醋液收干，120 ℃ 下干燥 30 min，取出，稍冷后干燥，即得［15］。

2.2 总姜黄素制备 取去油醋制品药渣100 g，按不同体积分数乙醇、提取时间、提取次数进行试验，滤弃药渣，合并滤液，浓缩成稠浸膏，即得。

2.3 总姜黄素含有量测定

2.3.1 色谱条件［1］Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相乙腈-4% 冰醋酸（48 ∶52）；体积流量 1 mL／min；检测波长430 nm；柱温 25 ℃；进样量 10 μL，色谱图见图1，可知上述条件下各成分色谱峰分离度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素对照品适量，置于10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇约 8 mL，40 kHz 下超声溶解混匀，定容，作为贮备液，各取2 mL 于10 mL 棕色量瓶中，定容，混匀，即得。

2.3.3 供试品溶液制备［16-17］取 “2.2”项下 9份稠浸膏，每份 1 g，置于 100 mL 锥形瓶中，精密加入 50 mL 甲醇，摇匀，密塞，称定质量，超声1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 取 “2.3.2”项下贮备液，倍比稀释成系列质量浓度对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度试验 取 “2.3.2”项下对照品溶液，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定 6 次，测得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素峰面积RSD 分别为0.09%、0.12%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一批稠浸膏，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h 在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素峰面积RSD 分别为1.85%、0.81%、0.46%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取同一批稠浸膏，同法提取后在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素峰面积RSD 分别为1.04%、0.17%、0.14%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密量取双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素含有量已知的稠浸膏 6 份，加入对照品溶液，按 “2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.4 正交试验 选择乙醇体积分数（A）、乙醇用量（B）、提取次数（C）、提取时间（D）作为影响因素，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素含有量作为评价指标，设计 L9（34）表，因素水平见表3，结果见表4，方差分析见表5。由此可知，各因素影响程度依次为A＞C＞B＞D，因素 A对各成分含有量有显著影响（P＜0.05），最优工艺是 A3B1C1D1，即加入 3 倍量 95% 乙醇提取 1 次，每次1 h。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 试验设计及结果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.5 人工神经网络法 以 “2.4”项下数据为训练样本，建立人工神经网络模型，以乙醇体积分数、乙醇用量、提取次数、提取时间为输入节点，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素含有量为输出节点，建立并训练该网络模型。再以纵坐标为网络数据预测，横坐标为正交试验结果，发现实验数据基本都集中分布在实线与虚线重叠的直线上，理想回归直线与最优回归直线几乎全部重合（相关系数分别为 1、0.999 9、1），而且网络期望输出和实际输出的相对误差均小于1%，表明其性能和预测能力良好，最优工艺加入3 倍量95%乙醇提取 2 次，每次 2 h。

2.6 验证试验 称取6 份去油醋制品药渣，每份100 g，分别按正交试验、人工神经网络优化工艺平行3 次验证试验，测得双去甲氧基姜黄素含有量分别为 1.00 μg／mL（RSD=0.42% ）、1.12 μg／mL（RSD=0.14%），去甲氧基姜黄素含有量分别为17.52 μg／mL（RSD=0.43%）、19.83 μg／mL（RSD=1.06%），姜黄素含有量分别为 28.29 μg／mL（RSD=0.43%）、30.00 μg／mL（RSD= 1.04%）。由此可知，人工神经网络优化后各成分含有量较高，重复性较好。

3 讨论与结论

人工神经网络是模拟生物学中大脑和神经系统的一种算法模型，广泛用于信息处理与分析，由接受信息的输入层、输出信息的输出层以及中间隐含层构成，见图2。该方法在处理非线性问题上独具优势，能很好地反映对象输入、输出之间复杂的非线性关系［18］，很多学者将传统方法（如正交试验）与其相结合来模拟试验过程，可减少大量反复的验证性工作，更方便快捷地获得多因素连续区域中的最优组合［15，19-20］。

图2 人工神经网络模型结构Fig.2 Model structure of artificial neural network

本实验结合人工神经网络与正交试验，得到醋制蓬莪术中总姜黄素最优回流提取工艺为加入3 倍量95%乙醇提取2 次，每次2 h，人工神经网络优化后双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素含有量分别为 1.12、19.83、30.00 μg／mL，均高于正交试验优化后，而且该方法稳定可行，重复性好。但目前对醋制蓬莪术中提取得到的总姜黄素缺乏一套完整的质量标准控制体系，仍未将体外提取工艺和体内药效学表征有机结合起来，醋制后破血消癥功效增强的物质基础和体内具体的作用机制尚不清楚，亟待更深入考察。