苦莪洁阴凝胶配方提取物联合黄柏提取物的抗菌作用初探

李定祥 蒋利利 刘桂杰 张杰*

苦莪洁阴凝胶由苦参、莪术、苍术及冰片四味药组成，具有行气破瘀、燥湿杀虫、生肌止痛之功效，药效学研究［1］表明苦莪洁阴凝胶对妇女常见致阴道炎细菌、真菌均有明显的体外抑菌作用。近年来临床病例显示金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌等是妇女细菌性阴道炎的常见致病菌［4-6］。为了增强苦莪洁阴凝胶的疗效，本实验以上述常见致病菌为菌株，通过比较苦莪洁阴凝胶配方提取物中加入不同比例黄柏提取物后的抗菌活性，来探析两者联合使用后的协同作用，以指导寻找更有效的治疗阴道炎的中药配方。

1 材料与方法

1.1 实验药物 样品：苦莪洁阴凝胶配方提取物（批号：171201）和黄柏提取物（批号：180101），由贵阳新天药业股份有限公司提供。

1.2 实验菌株和培养基 实验菌种：金黄色葡萄球菌菌株（MU50），金黄色葡萄球菌菌株（USA300），大肠埃希菌菌株（AB1157），绿脓杆菌菌株（PAO1）。大肠LB 培养基，葡萄球菌TSB培养基。

1.3 仪器设备 超净台和37℃恒温培养箱（日本三洋电子有限公司）。

1.4 实验试剂 去离子水，无菌蒸馏水，乙醇，盐酸，氨水，10%硅钨酸试剂，活性炭，氯化钠，强酸性阳离子交换树脂。

1.5 方法 （1）苦莪凝胶配方提取物制备方法：苦参提取物：取苦参药材（苦参碱、氧化苦参碱总量＞1.2%），分别加10倍量水煎煮三次，1h/次，滤过，合并滤液，减压浓缩，放冷，加乙醇使含醇量达75%，静置冷藏24h，滤过，滤液减压回收乙醇，加盐酸调pH2～3，静置12h，滤过，滤液通过已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱，加完药液后，以去离子水继续洗脱至水洗脱液pH 6～7，弃去水洗液；加浓氨水浸泡2h，再以10%的氨水液洗脱，以10%硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止，收集洗脱液，减压回收至无氨味，加水至350ml，加入活性炭，加热煮沸后保持微沸30min，趁热滤过，滤液浓缩成浸膏，并干燥至固体。莪术、苍术挥发油制备：取莪术、苍术，粉碎成粗颗粒，加8倍量水蒸馏提取6h，收集馏出液，加入氯化钠使含盐量达15%，冷藏12h，分取上层油液（挥发油成分），备用。（2）黄柏提取物：黄柏药材（小檗碱含量＞3.0%），采用水加热提取、醇沉的方法，制成黄柏提取物。（3）试验药物：取苦参提取物25.2g，加入挥发油0.2464ml，冰片0.7g，共计26.15g，得苦莪凝胶配方提取物（A）。取黄柏提取物5.0g，得B。然后将A与B按表1中的比例配制成各试验组药物，编码1-5#（见表1）。（4）最低抑菌浓度（MIC）试验方法：分别称取试样1-5#于无菌试管中，以无菌蒸馏水稀释10倍。加热培养基至约80℃，吸取5ml培养基于试管中，吹吸数次以溶解凝胶，然后倾注细菌培养基平板，各平板含药终浓度以倍释法稀释。用生理盐水稀释各菌种，比浊法配制成15×105CFU/ml菌液。取各菌液接种环（约10μl）分别接种于含不同浓度试样或空白样的各培养基上，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌置普通温箱内37℃培养24h后观察结果。同样方法将各菌接种于不含试样的相应培养基内并培养。

表1 试验药物配制及浓度

2 结果

观察各培养基上各细菌生长情况，以完全无菌生长的试样最高稀释度为该试样的MIC。与1#苦莪凝胶配方提取物比较，加入黄柏提取物后，提高了针对金黄色葡萄球菌的抗菌效果2～8倍；黄柏提取物针对金黄色葡萄球菌效果优于其它菌株（见表2）。

表2 试验药物最小抑菌浓度MIC

3 讨论

在正常状态下，构成阴道感染的正常菌群有20 多种微生物，各种菌群之间相互制约、相互协调，共同构建阴道微生态平衡。由于受到自身或外部环境的影响导致阴道菌群紊乱，从而引发阴道炎症。伍宗惠等［5］报道了386例阴道炎阴道菌群紊乱患者的病原菌分布情况，通过培养、分离共检出433株病原菌，其中革兰阳性菌252株（58.20%），革兰阴性菌113株（26.10%），真菌68株（15.70%）。其中包括革兰阳性菌金黄色葡萄球菌28株（6. 47%），革兰阴性菌大肠埃希菌46株（10. 62%）。此外，袁秀兰等［6］对非淋球菌性阴道炎患者细菌感染检测分析发现，860 份阴道分泌物标本中558份有病原菌生长，共分离得到653 株细菌，其中单株菌感染398 例，多重感染160 例，检出率64.88%（558/860）。革兰氏阳性球菌的检出率30.17%（197/653），主要为金黄色葡萄球菌（95株，14.55%）、化脓链球菌、粪肠球菌及溶血葡萄球菌。革兰氏阴性球菌的检出率69.83%（456/653），主要为大肠埃希菌（111株，17.00%）、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、粪产碱杆菌及洛菲不动杆菌。因此本实验选择临床菌株金黄色葡萄球菌MU50、USA300和Newman、大肠埃希菌AB1157以及绿脓杆菌（PAO1）作为实验菌株，进行抗菌活性筛选。

已有临床研究报道［2］，苦莪洁阴凝胶治疗细菌性阴道病湿热下注证的中医证候疗效明显优于安慰剂；苦莪洁阴凝胶与复方甲硝唑栓比较，治疗细菌性阴道病湿热下注证，在细菌性阴道病消除率、综合疗效、中医证候疗效等方面两者均无明显差异。黄柏，习称“川黄柏”，为芸香科植物黄皮树Phellodendron chiltense Schneid．的干燥树皮。具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，是临床常用的清热燥湿药。黄柏的主要化学成分为小檗碱、黄柏碱等生物碱类成分，具有抗菌、消炎等药理作用［3］。为了更好的提高苦莪洁阴凝胶的临床疗效，本实验欲研究苦莪洁阴凝胶提取物与黄柏提取物是否具有协同增效作用。实验结果表明，苦莪洁阴凝胶提取物加入黄柏提取物后，针对金葡菌的MIC显著降低，抗菌能力成倍增加，说明苦莪合用黄柏有协同增效作用，该研究为开发更有效的治疗细菌性阴道炎的中药配方提供了可靠依据。