外周血Treg细胞亚群及其细胞因子与心肺功能在COPD稳定期患者中的相关性研究

陈玮 郝建 蔡秋萍 钱钧 吴海燕 侯晓丽

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive PulmonaryDisease，COPD）由环境中明显的暴露因子所引起气道和/或肺泡异常所致肺泡功能单位的结构破坏［1］，其作为一种可预防可治疗的临床常见疾病之一，以气流受限为特征。在COPD的发生发展中，呼吸道持续存在的慢性炎症，与其心肺运动功能的减退有密切联系［2］，CD4+T细胞介导的免疫学机制同样发挥着重要的作用［3］。CD4+T细胞在不同的细胞微环境中，可以分化为Treg和Th17细胞亚群，Th17可通过分泌IL-6、IL-7、IL-17、IL-21、IL-22等炎性细胞因子来募集巨噬细胞和中性粒细胞，促使炎性因子的释放并加剧炎症反应［4-6］。Treg细胞通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子对疾病的炎症反应起到抑制的作用［7-8］，减轻自身的免疫应答和降低氧化反应所致的损伤。本课题希望通过研究Treg细胞亚群、细胞因子IL-17和TGF-β与心肺功能和肺功能之间的相关性来探讨慢性炎症对COPD患者临床症状及运动耐量降低的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取在2016年1月至2017年12月期间中国人民解放军杭州128医院COPD稳定期患者30例设为观察组，体检中心健康人员30例设为正常组。两组性别、年龄、体重、身高差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。入选标准：（1）符合中华医学会2016年COPD诊断和分组标准；（2）病情严重程度：选取中重度的COPD缓解期患者且不伴有肺动脉高压；（3）曾使用有创或无创机械通气治疗；（4）无严重心、肝、肾及其他影响锻炼的局部或全身性疾病；（5）排除急性发作者；本项目必须经过医院医学伦理委员会批准，同时取得患者及其家属的知情同意，并签署同意书。

表1 两组一般临床资料比较（x±s）

1.2 实验方法及测定 （1）流式细胞学测定：研究对象分别通过流式细胞计数测定血清中的Treg亚群细胞比例，研究方法和测定过程如下。①准备细胞：分别抽取患者空腹状态下的肘静脉血6ml，均分3ml分别置于已备制的200μl抗凝血（肝素）的2只试管内，然后，加入2ml 1X Lysing solution（10X加水稀释）破膜10min后，作离心处理，以200r/min离心5min，随后加入2ml staining buffer（PBS-BSA）重悬细胞固定5min，以相同转速再次离心5min，吸取上清液，加入150μl staining buffer重悬细胞备用。②表面抗体染色：取100μl细胞悬液，加入相应的表面抗体染色，保存于4℃保存箱中30min，结束后加入2ml staining bufler后以200 r/min离心5min。③固定及胞内染色：在备用细胞悬液管中，加入1ml 1X Fix/Perm buffer，4℃放置50min，加入1ml 1X Perm/wash bufler，350r/min，4℃离心5min，再次加入2ml 1X Perm/wash bufler，重悬细胞，350r/min，4℃离心5min，每管加入100μl 1X Perm/wash bufler重悬细胞，加入FOXP3和IL17A胞内，混匀细胞，之后加入2ml IX Perm/wash bufler，350r/min，4℃离心5min，弃上清液，重复操作，加入350μl staining buffer重悬细胞后上机检测，以上操作实验均在浙江中医药大学临床基础研究所流式细胞室内完成。（2）细胞因子测定：研究对象使用ELISA方法检测相关细胞因子表达情况，具体实验方法及测定如下。抽取患者肘静脉血中的上清液200μl至离心管中。在20℃下，以200r/min速度离心4min。随后通过ELISA法检测各组实验血清中的细胞因子的浓度，实验步骤严格按照试剂盒说明进行操作，实验地点位于浙江中医药大学临床基础研究所。上述测量指标主要试剂及仪器：流式细胞检测过程中所使用的试剂购自上海优宁维生物科技股份有限公司；Human IL-17 ELISA KIT、Human TGF-β ELISA KIT等购自杭州达真生物技术有限公司；Bio-Tek ELX800全自动酶标仪，DGG-9240A型电热恒温箱，微量移液器（京君龙实验仪器北京有限公司）；台式冷冻离心机centrifuge 5804R（Univer，德国）；4℃保存箱（Panasonic，日本）。（3）肺功能指标：凡入选对象均采用肺功能仪（CHEST AC-8800，日本）监测正常组及观察组用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV1/FVC）等指标，以上指标的测量在杭州128医院心肺康复科实验室完成。（4）心肺功能运动试验（CPET）指标：采用心肺运动仪（Cosmed 2900型，意大利）监测正常组及观察组峰值公斤摄氧量（Peak VO2/kg）、峰值功率（Peak Power）、CO2排出量（Peak VCO2）等指标。运动方式：为踩功率车；运动内容：开始时，在10W功率的情况下运动10min，再通过取无氧阈时功率的70%，作为运动负荷完成运动，以上指标的测量在杭州128医院心肺康复科实验室完成。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验比较各组间的均数差异，计数资料数据采用χ2检验，各组间数据的相关关系使用pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Treg亚群细胞比例及外周血中细胞因子的变化情况 观察组患者外周血中的Treg亚群细胞比例较正常组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组患者外周血中的细胞因子IL-17及TGFβ表达水平较对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 两组外周血Treg亚群细胞比例、细胞因子变化情况（x±s）

2.2 心肺运动功能及肺功能变化情况 观察组患者的Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2较正常组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组患者的FVC和FEV1/FVC较正常组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表3）。

表3 两组心肺运动功能及肺功能变化情况比较（x±s）

2.3 Treg亚群细胞及血中细胞因子与心肺运动功能的相关性 观察组患者Peak VO2/kg、Peak Power、Peak VCO2与Treg细胞亚群比例呈正相关（P＜0.05），上述指标与IL-17及TGF-β表达水平呈负相关（P＜0.05）（见表4）。

表4 观察组外周血炎性因子水平与心肺运动功能的相关性（x±s）

3 讨论

在多种疾病的发展过程中，Th17和Treg细胞亚群比例失调起到重要的作用，例如急性冠脉综合征（ACS）［9］、类风湿关节炎（RA）［10］和银屑病［11］等。在特定的微环境中，受不同受体特异性调控，在IL-6、TGF-β的诱导下CD4+细胞趋向分化为Th17细胞亚群；而在TGF-β的刺激下，趋向分化为Treg细胞亚群。Pack等［12］新发现，Th17作为Th细胞亚群的一种，其介导的自身免疫应答与Treg亚群所具有的免疫抑制作用，在功能上相互拮抗，在正常机体内维持动态平衡，并对炎症反应的发生和维持免疫耐受起到重要的作用。许多研究表明，Th17/Treg的失衡在免疫性疾病中发挥重要的作用。

研究已表明，慢性炎症反应是COPD不断进展的重要原因［13］，巨噬细胞在其外周的气道、肺实质和肺部血管中增加，同时活化后的中性粒细胞和相关淋巴细胞可以增加炎症因子的释放，增加气道的高反应性，使得气道重塑，导致肺功能的进一步损伤［14］。

多项研究表明，COPD稳定期患者外周血中的Treg细胞亚群比例明显降低，而细胞因子IL-17及TGF-β表达水平升高［15］，提示稳定期的COPD患者，其免疫平衡状态受到破坏，介导炎症作用的细胞因子表达加强，而抗炎作用减弱。本实验中，观察组Treg细胞亚群比例较正常组明显降低，IL-17及TGF-β表达水平较正常组升高，此况与文献报道情况相似，提示COPD患者炎性细胞因子显著上升，抑制性炎症因子下降，机体的免疫平衡遭到破坏，机体对抗炎性物质的能力下降。虽然由Treg细胞亚群分泌的TGF-β作为一种抑制性炎症因子，调控抑制淋巴细胞增殖，但其同样也可诱导炎性细胞趋化，成为炎症反应发生的媒介，在COPD患者中出现升高的趋势。本组实验研究提示，通过CPET所测得的Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2，均显著性低于正常组；同时肺功能所测得的FVC和FEV1/FVC也显著性低于正常组，提示随着患者免疫平衡破坏，机体持续维持应激状态，致肺功能的损害进一步的发生，使其心肺功能储备及运动耐量下降，生活质量逐步下降。CPET指标Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2与Treg细胞亚群水平呈正相关，而与血清IL-17、TGF-β成负相关，提示COPD患者的心肺功能降低程度与机体内的炎症反应呈正相关，随着慢性炎症反应持续发生，其心肺功能逐渐降低，使得COPD患者气流受限加重，呼吸道症状反复发作。

综上所述，在COPD患者气道慢性炎症的发展过程中，Treg细胞亚群及其相关细胞因子比例的失调起到重要的作用，可以发现Treg细胞亚群比例及其细胞因子对COPD稳定期患者临床症状、健康状态及运动耐量均有显著的相关性。在今后的研究中，注重观察对Th17/Treg细胞亚群比值与CPET对其他呼吸系统疾病的影响，进一步探讨慢性炎症反应对呼吸系统气道高反应性的作用机制。