caspase-7/12与儿童原发性EBV感染肝损伤的相关性研究

胡玲珑 王菊香 周海霞 李原

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是非嗜肝病毒感染引起儿童肝损害的常见病原体，原发性急性EBV感染可导致82%的患儿出现肝功能损伤［1］，大部分患儿的症状会在治疗1周内减退［2］。目前对EBV感染导致肝功能损伤的机制尚未完全明确。探索EBV感染后机体内与肝功能损害分子的表达情况，将为EBV感染导致肝功能损伤的防治提供新的思路和策略，有助于阐明EBV感染诱导肝功能损伤的内在分子机制。Caspase7/12是导致肝细胞凋亡的主要分子蛋白，但是否与原发性EBV感染导致的肝功能损伤存在相关性，目前尚未明确。本课题通过收集患儿肝功能数据，并采用ELISA法检测患儿血液中肝细胞损伤相关分子蛋白的表达，探索原发性EBV感染肝功能损害与caspase7/12表达变化的相关性及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年1月至12月在本院住院治疗的原发性EBV感染患儿236例，EBV-IgM检测均为阳性，其中伴有肝功能损伤的162例为肝功能异常组，分别检测其急性期及恢复期实验室指标，恢复期抽血时间为住院治疗第7天，肝功能正常的74例为肝功能正常组，年龄1～14岁；肝功能异常组按年龄再分为4个亚组，包括幼儿组（1～3周岁）37例，学龄前组（4～6周岁）41例，学龄组（7～10周岁）35例，青少年组（11～14周岁）49例。收集相关的肝功能数据。标本采集获得患者或家属知情同意，本研究通过本院伦理委员会审核同意。

1.2 ELISA方法检测血清caspase-7/12蛋白的表达水平 Caspase-7/12ELISA试剂盒为美国PeproTech公司生产；抗Caspase-7/12抗体购自英国abcom公司提供。取caspase-7/12酶联免疫试剂盒，室温下静置30 min，每孔加50μl标准样品或待测样品，留2孔为空白对照孔；塑料薄膜覆盖微孔板，孵育2h；洗板4次，反转酶标板，拍干各孔剩余的洗涤液；每孔加50μl生物素标记的抗caspase-7/12抗体，塑料膜封板，孵育2h；洗板4次，反转酶标板，拍干各孔剩余的洗涤液；每孔依次序加入显色剂A和显色剂B，避光室温孵育30 min；加入反应终止液100μl，自动酶标仪于450nm处测定各孔的光密度（OD）值；以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品所测OD值确定其浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，正态分布资料采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，方差不齐则采用Tamhane's T2检验，计数资料应用χ2检验，两组数据采用双变量相关性分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能异常组和肝功能正常组以及肝功能异常组急性期和恢复期各肝功能指标比较 肝功能异常组谷氨酸转氨酶（ALT）数值明显高于肝功能正常组（P＜0.001）；天冬氨酸转氨酶（AST）和总胆红素（TBLL）差异均无统计学意义。肝功能异常组中急性期和恢复期进行比较ALT差异有统计学意义（P＜0.001），其余差异均无统计学意义（见表1）。

表1 肝功能异常组中急性期与恢复期ALT、AST和TBLL的比较（x±s）

2.2 肝功能异常组中各年龄分组间ALT差异比较 青少年组ALT与其它各组比较差异有统计学意义（P＜0.001），余指标在各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

表2 肝功能异常组中各年龄组ALT、AST和TBLL的比较（x±s）

2.3 肝功能异常组和肝功能正常组间caspase-7/12比较 见表3。

表3 肝功能异常组和肝功能正常组间caspase-7/12比较（x±s）

2.4 肝功能异常组急性期和恢复期caspase-7/12比较 见表4。

表4 肝功能异常组急性期和恢复期caspase-7/12比较

2.5 肝功能异常组中各年龄组间caspase-7/12比较 肝功能异常组中按年龄分4个亚组，只有青少年组的caspase-7/12与其它组的比较差异有统计学意义（P＜0.001），余各组之间的caspase-7/12两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表5）。

表5 肝功能异常组中各年龄组caspase-7/12的表达水平比较（x±s）

2.5 肝功能异常组急性期和恢复期caspase-7/12与ALT相关性分析 肝功能异常组中急性期caspase-7/12的表达水平与ALT存在线性相关（r=0.965，P＜0.001）（见图1）。

图1 肝功能异常组急性期ALT与caspase-7/12的相关性分析

3 讨论

EBV是临床上最为常见的导致儿童肝损伤的非嗜肝病毒，属4型疱疹类病毒。肝功能损伤是原发性EBV感染最为常见的并发症之一，但EBV感染如何导致肝损伤，其病理生理机制目前尚未完全明确。新的国内研究表明，EBV感染与乙肝病毒感染诱导的肝损伤存在相似性，可能与B淋巴细胞活动存在某种协同作用［3］；Zekri在研究临床丙肝时发现，如果EBV感染处于活动期，患者的转氨酶升高明显［4］；在2000年时有研究揭示EBV感染可以激活机体免疫能力相关的因子，进而导致各脏器损伤，主要表现为细胞的凋亡［5］。

在诱导细胞凋亡的整个过程中，细胞内caspase系列蛋白酶的激活起着重要作用。目前已经明确的凋亡通道有三种，分别是caspase-8参与传递的细胞外信号凋亡通路，caspase-9参与介导的线粒体途径诱导的细胞凋亡，以及caspase-12参与诱导的内质网应激细胞凋亡信号通路，在这三条caspase参与介导的细胞凋亡信号通路，最后都需经过caspase-7 起效应［6］。众多临床实验的研究文献提示在肝炎患者中，肝细胞的损伤一般表现为凋亡的过程，并且和caspase系列蛋白分子依赖的细胞凋亡过程紧密相关，其中介导细胞凋亡信号通路的caspase-7/12作用最为显著，在一些研究乙肝、丙肝的临床实验文章中，绝大部分患者血清中caspase-7/12的表达水平出现明显升高［7-8］，Masuoka HC在细胞实验中通过使用caspase抑制剂来治疗丙肝，取得了显著的效果［9］，但caspase-7/12与原发性EB病毒感染诱导的肝功能损伤是否存在内在的相关性，目前尚未完全阐明。

本研究发现，原发性EBV感染患儿血清中 caspase-7的表达水平明显上升，且肝功能异常组中ALT、caspase-7/12的表达水平明显高于肝功能正常组。既往在对丙肝的研究提示在肝炎患者中caspase-7/12表达水平的上升可直接诱导细胞的凋亡，导致肝功能的损伤，而采用caspase的抑制剂后，caspase-7/12表达下降，部分患者肝功能恢复正常。在肝功能异常组患儿中，急性期患儿的caspase-7/12以及ALT表达水平明显高于恢复期患儿，通过相关性分析发现当EBV感染后，急性期caspase7/12的表达与ALT的升高存在线性相关，提示原发性EBV感染所致肝功能的损伤与caspase7/12之间存在密切的内部联系。同时根据年龄分组，青少年组的caspase-7/12以及ALT表达水平明显高于其它3组，与香港儿童EBV感染导致肝功能损伤的研究中发现随着年龄的增长肝功能的损害越明显的结果一致［10］。

因此，caspase-7/12的高表达与儿童原发性EBV感染所致的肝功能损害密切相关，同时ALT的升高与caspase-7/12的表达水平存在线性相关。