尼可地尔对兔实验性空气肺栓塞动脉高压的作用研究

王海鹏 屈百鸣 张健

肺 动 脉 高 压（pulmonary arterial hypertension，PAH）由世界卫生组织（WHO）划分为原发性肺动脉高压和继发性肺动脉高压，其中继发性肺动脉高压发病率较高，是由多种疾病逐渐发展出现肺血管阻力，右心负荷升高最终导致右心功能衰竭的一组临床病理综合征［1］。继发性肺动脉高压相关的治疗仍是目前医学难点，现多项临床研究已经证实KATP通道参与了血管收缩和重构的病理过程，对舒张肺血管效果明显［2］。缺氧状态时KATP通道开放剂能够显著提高肺动脉平滑肌细胞上钾离子通道的活性，对舒张肺血管效果较为明显［3］。本实验研究应用的尼可地尔属于烟酰胺类KATP通道开放剂，化学名硝酸乙氧烟酰胺，其作用机制主要可归纳为使血管平滑肌松弛和血管舒张［4］、改善肺动脉血管的重构。作者自2013年1月至2014年12月通过动物实验探究尼可地尔对肺动脉高压的疗效，将肺动脉压力测定、超声评估等方面作为研究重点。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级新西兰大白兔50只，体重1.6～2.0kg，雌雄不限，兔龄5～6个月，由浙江中医药大学实验动物中心提供。RM6240系列多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂），全功能心电监护仪（spacelabs德国西门子公司），有创动脉血压压力换能器（深圳市新世联科技有限公司），动静脉留置针（24G*0.75IN，苏州碧迪医疗器械公司），20%氨基甲酸乙酯注射液（乌拉坦）（西安医科大学药厂生产），尼可地尔片 5mg×100（日本 Tohoku Nipro Pharmaceutical Corporation），光学显微镜（浙江中医药大学病理实验室提供）。采用计算机随机数发生器将动物随机分为3组，分别为普通对照组15只、肺动脉高压模型组20只和尼可地尔药物组15只，称重并记录。

1.2 实验方法 （1）兔实验性肺动脉高压模型的制作：实验兔分别固定于活动式立式兔实验固定台上，1ml注射器经耳缘静脉建立静脉通道，实验每日同一时段重复注射，连续28d。①普通对照组：经耳缘静脉缓慢注射生理盐水，剂量为0.3ml/（kg·10min），注射完毕后观察15min，确认生命体征平稳后放回兔笼。②肺动脉高压模型组：经耳缘静脉缓慢注射空气团，剂量为0.3ml/（kg·10min），注射完毕后观察15min，确认生命体征平稳后放回兔笼。③尼可地尔药物干预组：操作同肺动脉高压组实验兔。此外，尼可地尔片溶解于生理盐水后灌胃，剂量为1.15mg/kg，灌胃3次/d，重复28d，灌胃完毕后观察15min/次，确认生命体征平稳后放回兔笼。（2）肺动脉内径及Tei指数的超声分析：实验方法：将实验兔水合氯醛（2.5ml/kg）灌肠镇静，左侧仰卧位四肢固定于木板上，使木板向左倾斜30°，8%硫化钠溶液均匀涂抹于胸前区，剃净胸毛，使用GE公司Vivid 7 Dimension超声心动图仪，M3S探头，频率1.5～3.5MHz。超声探头置于兔胸骨左侧进行测量，获取心底短轴及心尖四腔切面，测定肺动脉内径（如图1）。启用定量组织速度成像模式，取样点置于右室游离壁三尖瓣环位置，以TDI的速度脉冲方式显示三尖瓣环运动频谱 ：收缩期s波、舒张早期e波，舒张晚期a波（如图2），测量右室等容收缩时间（ICT）、等容舒张时间（IRT）及射血时间（ET），计算右室Tei指数（如图3）。选择清晰的图像保存待以后分析，每只取3个心动周期平均值［5］。Tei=（ICT+IRT）/ET；A：a波终末至下一心动周期e波起始的间期=（A-B）/B；B：a波终末至下一心动周期s波的终止间期（3）兔实验性肺动脉高压模型建立及尼可地尔干预组、正常对照组的肺动脉压力测量：①实验动物准备：兔固定于兔实验台上，经耳缘静脉予静脉留置针建立静脉通道，肝素封管。用20%乌拉坦溶液经耳缘静脉缓慢注射麻醉，麻醉剂量为5ml/kg。用8%硫化钠溶液分别于近躯干右上肢、左上肢、右下肢及左下肢皮肤上（各部位面积约3cm×5cm）进行脱毛，胸骨处（面积约5cm×5cm）进行脱毛。切开气管并插入气管导管以备接呼吸机用。准备压力换能器再连接到多通道生理仪，连接ECG，以监测心率，心律。②肺动脉压力测定：实验兔胸骨柄左缘第二肋开始切开约2cm手术切口，依次为皮肤、皮下筋膜、肌肉、肋骨。以120mm小三爪自动牵开器缓慢扩张胸骨切口。暴露切口，不打开心包，弯钳缓慢剥离甲状腺，即可定位肺动脉主干，动脉穿刺针穿刺肺动脉并置管，固定后接压力换能器再连接到多通道生理仪，监护仪上可见肺动脉压力波形（如图3），稳定1～2min后，分别记录肺动脉的收缩压、舒张压和平均压。③实验观察与记录：多道电生理仪记录实验兔肺动脉压力，应用RM6240系列多道生理信号采集处理系统软件处理并分析实验动物肺动脉压力，以区域测量方法测得肺动脉压力舒张压、收缩压、脉压差、平均压。

图1 超声心动图测量肺动脉内径

图2 多普勒超声心动图测量

图3 肺动脉压力波形图

1.3 统计学分析 采用 SPSS18.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，三组间Tei值比较采用单因素方差分析，肺动脉内径比较采用t检验，肺动脉压力比较进行两个独立样本Mann-Whitney检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声心动图评价 超声测量的各组肺动脉内径值比较见表1。各组ICT、IRT、ET及Tei指数比较见表2。

表1 各组肺动脉内径值比较（x±s）

表2 各组ICT、IRT、ET及Tei指数比较（x±s）

2.2 三组肺动脉压力测定比较 见表3。

表3 三组肺动脉压力测定比较［mmHg，（x±s）］

3 讨论

目前肺动脉高压的制作模型多应用低氧环境下饲养［6］、野百合碱药物注射［7］、高血流量外科手术［5］等方法制作，其中应用最为广泛的是缺氧舱下制作的低氧性肺动脉高压大鼠模型。本实验创新性的选择使用“空气肺栓塞”的方法建立肺动脉高压的兔实验模型。最后测得13只实验兔的平均压力为（38.763±7.000）mmHg，相对于正常对照组实验兔测得肺动脉平均压（22.413±0.913）mmHg明显升高约16mmHg，符合肺动脉高压的肺动脉压力诊断标准，且通过超声评价所得出的结果一致性较强，可得知本实验中这种新型的“空气栓塞”法建立肺动脉高压模型的方法是成功且为可复制的，为肺动脉高压治疗的研究提供了一种新型的动物模型建立方法。“空气栓塞”的方法建立肺动脉高压的动物模型具体生理机制为：空气在血管中形成小的气泡通过右心房进入右心室，在右心室被击碎成极小的气泡进入肺动脉，在细小的肺动脉中形成栓塞，从而造成了实验动物的缺氧状况，持续一段时间后融入血液，缺氧情况逐渐缓解。而连续28d的重复性操作，则会引起肺血管的收缩和重构。

新型的“空气栓塞”肺动脉高压动物模型较传统的肺动脉高压动物模型的优点主要包括：（1）简单经济：此模型制作方法简单，仅需在耳缘静脉建立静脉通道后用空气团注射即可；且所使用的实验设备较少，仅需实验兔固定台、一次性注射器和留置针。（2）可复制性强：本实验对实验动物的饲养条件要求较低，且无需建立专门的低氧舱，可以大批量的复制动物模型。（3）使用动物更广泛：本实验可在兔上成功建立模型，为肺动脉高压的动物模型家族增添新的成员。（4）更接近临床：注射野百合碱作为最为经典的肺动脉高压模型建立方法被广泛应用，但其主要是野百合碱通过炎症反应损伤肺动脉内皮，诱导肺动脉血管重建来建立的接近结缔组织相关肺动脉高压发病机制的动物模型。与临床上常见的低氧性肺动脉高压的发病机制有一定的差异［8］。

当然，任何新的事物的出现都是一个从基本逐渐走向完美的过程，本实验中创新性的建立空气栓塞肺动脉高压实验兔模型优点突出，而在具体的操作过程中遇到的困难也不可忽略。在实验过程中主要的困难包括：（1）操作要求严格：因为每个动物的体质差异，在实验过程中，空气团注射是较为困难的操作，既要求注射速度适中，也需在动物出现不能耐受的情况下及时停止操作，避免动物的死亡。（2）感染情况：兔肺部娇嫩，极易出现肺部感染，而空气的注入则会加大肺部的感染率，且在模型建立后期，因肺动脉高压导致的右心功能减退，也会出现肺瘀血等症状，从而出现肺部感染。在实际操作过程中，有近1/10的实验兔因肺部感染严重而不能作为模型参与实验。（3）病死率：空气注射对注射方法、时间及速度要求严格，否则会出现实验动物的死亡，在具体的实验过程中确实出现猝死现象。

目前超声心动图作为一项无创检查技术为肺动脉高压的诊断提供了非常重要的依据，与右心导管检查有较好的相关性，其诊断价值已得到广泛认可。超声心动图既可以对肺动脉高压原发病能做出诊断，也能估测右心房压力、肺动脉的收缩压和舒张压。

在肺动脉压力测定的操作过程中主要出现的问题有：随着心脏的搏动，肺动脉导管测得的压力曲线也会出现相应的波动，这对肺动脉压力测定后的统计造成了一定的难度。在插入动脉留置针时需使用弯镊轻夹肺动脉壁，是否会造成肺动脉交感兴奋收缩从而导致压力增高及开胸对肺动脉压的影响仍有待进一步的论证。

本次试验的对象是新西兰大白兔，在物种上、实验动物的数量，以及实验模型同临床实际疾病的发生还是存在一定差异，但实验结果显示了尼可地尔在抗兔肺动脉高压方面发挥了积极作用，为进一步的研究打下基础。