产细菌素肠球菌的分离及其抑菌谱的筛选

张 迅， 路振香， 朱元召， 孟婷婷

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

自20世纪初发现青霉素以来，各种各样的新型抗生素陆续涌现，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类等，为人类与畜牧业做出巨大的贡献。但随着抗生素应用的日益增多，抗生素的不规范、不合理使用以及滥用问题日益严重，造成病原菌耐药性不断增强，甚至出现了病原菌的多重耐药性和交叉耐药性，给临床上的治疗带来了很大的挑战[1-2]。而且，畜牧产品中存在的抗生素残留问题，亦是威胁食品安全并影响人类健康的又一问题，这些问题使得寻找抗生素替代品的任务迫在眉睫。

细菌素是细菌产生的一种具有杀菌作用的蛋白质,只能作用于与其同种不同菌株的细菌，以及与其亲缘关系相近的细菌。虽然，细菌素与抗生素相比抑菌谱相对较窄，但是在食品工业的长期应用中，细菌耐受性很少出现。因此，认为细菌素是目前最有发展前景的抗生素替代物[3]。肠球菌(Enterococcus)是一类重要的益生菌，在动物肠道内生活，能够发酵糖类，并且能产生乳酸和细菌素等物质[4]。其中，具有广谱抑菌作用的肠球菌已被应用于食品发酵、疾病治疗和饲料添加剂等领域，例如，在欧洲，含有肠球菌的发酵剂常常被用于传统奶酪的生产[5]；在我国，具有肠球菌的混合菌剂则被用于治疗动物腹泻和肠道炎症等疾病[6]；而在动物饲料中添加乳酸菌制剂除了有一定的营养作用外，还可在一定程度上抑制腐败菌及病原菌的生长繁殖，从而促进动物肠道微生态平衡，提高动物免疫力，改善动物健康[7-9]。

肠球菌是一种兼性厌氧的产乳酸的细菌，容易分离得到，培养条件简单，适合于生产与应用。本试验采集大鼠、小鼠、黄牛、奶牛、山羊、家兔、鸡7种健康动物的粪便，用肠球菌选择培养基进行肠球菌的分离培养，用LB液体培养基进行细菌素的生产，粗提，并对27株细菌采用圆纸片法进行发酵上清液和粗提细菌素的体外抑菌试验，筛选抑菌谱，为细菌素的研究与应用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 分离自大鼠、小鼠、黄牛、奶牛、山羊、家兔、鸡的粪便中采集的7株肠球菌、分离自鸡、奶牛、黄牛、兔、小鼠的5株大肠杆菌、鸡致病性大肠杆菌1、鸡致病性大肠杆菌2、绿脓杆菌、枯草杆菌1、枯草杆菌2、金黄色葡萄球菌1、金黄色葡萄球菌2、分离自肠道、口腔、鼻腔、皮肤4株白色葡萄球菌、鸡白色葡萄球菌(致病性)、产气杆菌、沙门氏菌、鸡沙门氏菌(致病性)，共计27株。

1.1.2 培养基 Pfizer肠球菌选择培养基(PSE Agar)由青岛高科园海博生物技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 肠球菌的分离 分别采集大鼠、小鼠、黄牛、奶牛、山羊、家兔、鸡7种健康动物的粪便，在Pfizer肠球菌选择培养基(PSE Agar)上划线分离肠球菌，然后用烛缸法培养，于37 ℃培养18～24 h。

1.2.2 革兰染色镜检 挑取肠球菌选择培养基上的典型单个黑色菌落，革兰染色，油镜下观察。

1.2.3 肠球菌细菌素的生产 分别将上述分离到的7株革兰阳性球菌纯培养，接种于LB液体培养基中，放入37 ℃恒温箱培养48 h。

1.2.4 肠球菌发酵上清液的制备 取肠球菌的发酵液，于5 000 rpm，4 ℃条件下离心15 min，取上清液备用。

1.2.5 肠球菌细菌素的制备 肠球菌细菌素的提取方法参考Liu等[10]的方法，用硫酸铵盐析法提取：取肠球菌的发酵液，5 000 rpm，4 ℃离心15 min，取上清液备用，弃去菌体沉淀。在上清液中，一边缓慢搅拌，一边慢慢添加经过研磨的硫酸铵粉末，使其终浓度为80%，过程中，可以看得有片状沉淀浮现，然后置于4 ℃冰箱沉淀过夜。然后经12 000 rpm，4 ℃离心15 min，弃去上清液，将沉淀复溶于适量pH为7.0的磷酸缓冲液中，存放于4 ℃冰箱备用。

1.2.6 试验菌的培养 将27株试验菌划线接种至普通营养培养基上，置37 ℃培养18～24 h，备用。

1.2.7 抑菌试验

1.2.7.1 肠球菌发酵上清液抑菌试验 将7种发酵上清液分别将适量圆纸片浸泡于其中，30 min后取出，晾干备用。采用圆纸片法对试验菌分别进行抑菌试验。

1.2.7.2 肠球菌细菌素抑菌试验 将7种肠球菌粗提细菌素贮存液分别将圆纸片在其中浸泡30 min后，晾干，采用圆纸片法对试验菌分别进行抑菌试验。

2 结果与分析

2.1 肠球菌的分离与培养

用肠球菌选择培养基从7种健康动物的粪便中分离到7株肠球菌，细菌在肠球菌选择培养基上生长迅速，呈圆形黑色凸起，边缘光滑整齐的菌落(图1)。革兰染色镜检均呈单个蓝紫色球菌，为革兰阳性球菌。

图1 黄牛肠球菌菌落形态

2.2 肠球菌发酵上清液的抑菌试验

7株肠球菌发酵上清液的抑菌试验结果见表1，这7株肠球菌均有抑菌作用，但抑菌强度不同。大鼠肠球菌发酵上清液对黄牛肠球菌、白色葡萄球菌(肠道)、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，小鼠肠球菌发酵上清液对鸡大肠杆菌、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，鸡肠球菌发酵上清液对白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，兔肠球菌发酵上清液对黄牛肠球菌、鸡大肠杆菌、奶牛大肠杆菌、白色葡萄球菌(肠道)、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，黄牛肠球菌发酵上清液对鸡大肠杆菌、白色葡萄球菌(肠道)有抑制作用，山羊肠球菌发酵上清液对黄牛肠球菌、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，奶牛肠球菌发酵上清液对黄牛肠球菌、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用。而对肠球菌其他菌株、大肠杆菌其他菌株、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、产气杆菌、枯草杆菌无抑菌效果。

表1 肠球菌发酵上清液抑菌试验结果

注：Ⅰ:大鼠肠球菌；Ⅱ:小鼠肠球菌；Ⅲ:鸡肠球菌；Ⅳ:家兔肠球菌；Ⅴ:黄牛肠球菌；Ⅵ:山羊肠球菌；Ⅶ:奶牛肠球菌的发酵上清液；“-”表示无抑菌作用。下同。

图2 粗提细菌素对鸡致病性大肠杆菌

2.3 肠球菌粗提细菌素的抑菌试验

由表2可见，这7株肠球菌均有大小不同的抑菌作用(图2)。大鼠肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、小鼠大肠杆菌、产气杆菌、白色葡萄球菌(肠道)、白色葡萄球菌(口腔)、鸡白色葡萄球菌有抑制作用，小鼠肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、鸡致病性大肠杆菌2、小鼠大肠杆菌、产气杆菌、鸡白色葡萄球菌、沙门氏菌有抑制作用，鸡肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、小鼠大肠杆菌、鸡白色葡萄球菌有抑制作用，兔肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、小鼠大肠杆菌、鸡白色葡萄球菌有抑制作用，黄牛肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、鸡白色葡萄球菌有抑制作用，山羊肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、产气杆菌、鸡白色葡萄球菌有抑制作用，奶牛肠球菌细菌素对鸡致病性大肠杆菌1、小鼠大肠杆菌、产气杆菌、鸡白色葡萄球菌有抑制作用。而对肠球菌、大肠杆菌其他菌株、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌(鸡)、绿脓杆菌、枯草杆菌无抑菌效果。

由此可得，大鼠肠球菌和小鼠肠球菌的粗提细菌素抑菌谱较广，小鼠肠球菌的粗提细菌素抑菌作用最好。

表2 肠球菌粗提细菌素抑菌试验结果

3 结论与讨论

动物肠道中的肠球菌对动物的胃酸和胆盐的消化有较强的耐受作用，是益生菌来源的最好选择，在本试验中，采集包括大鼠、小鼠、黄牛、奶牛、山羊、家兔、鸡等在内的7种健康动物的粪便作为分离材料。基于肠球菌在肠道生活的生活环境，用肠球菌选择培养基来进行肠球菌的分离鉴定，再用革兰氏染色、镜检进行进一步的确定，最终分离到7株肠球菌。采用硫酸铵盐析法来提取细菌素，此法经济简单，易于操作，同时也可从一个方面证明肠球菌细菌素在高浓度盐溶液中变性析出的蛋白质特性。但是盐析的缺点是高浓度可能会使细菌素变性，从而使其抑菌活性降低[11]。所以，寻求更加经济方便、易于操作、不会对细菌素的理化性质造成影响的提取方法，有待于进一步探究。

试验所用的27株试验菌，既包括致病菌，也有分离自健康动物体内或体表的常在菌。本研究采用圆纸片法，分别对所分离肠球菌的发酵上清液和粗提细菌素的进行了体外抑菌试验。从试验结果可知：肠球菌的粗制细菌素的抑菌效果跟上清液的抑菌效果相比，抑菌谱更广，但抑制强度差距不大。肠球菌在代谢过程中可以产乳酸及细菌素，乳酸也具有一定的抑菌作用，在上清液中，酸与细菌素共同发挥抑菌作用，所以在试验中需要单独排除有机酸对指示菌的影响[12]。而粗提细菌素的提取液中，细菌素的纯度及浓度更大，具有更好的抑菌效果，但差距并不明显。

肠球菌细菌素具有抑菌作用，但抑菌效果不如抗生素的抑菌效果。一方面是因为细菌素相对于抗生素来说，抑菌谱较窄，只对有限的亲缘关系比较近的几种细菌有抑制生长作用；另一方面是可能是因为细菌素的纯度与浓度不高，使得所泡圆纸片上的细菌素含量偏低[13]。在这个致病菌耐药性日益严重的时代，对于细菌素的持续研究与深入探索，进一步在实际中投入与使用，希望能在缓解致病菌耐药性和超级细菌方面发挥一定作用。但是，对于寻找具有广谱抑菌作用的细菌素种类，仍需要进一步的筛选，而且，细菌素的产量与纯度及用量问题，将是研究者们面临的一大挑战。或许，可以从提高细菌素抑菌比活力和利用DNA重组技术合成满足人们要求的活性多肽或蛋白质等方面进行研究[14]。细菌素具有与抗生素饲料添加剂相近的有益作用，同时自身也具有许多优质特性，比如: 杀菌具有选择性、无副作用、不在动物体内蓄积、无抗药性，同时还具有耐低温贮藏，热稳定性等优质特性，所以细菌素在动物生产上的应用必将取得突破性进展[15]。

试验从7种健康动物的粪便中分离出7株肠球菌，通过对其粗提细菌素进行体外抑菌试验，结果表明：肠球菌细菌素具有抑菌作用，肠球菌细菌素不仅对白色葡萄球菌等革兰阳性菌具有抑制作用，同时对大肠杆菌、沙门氏菌、产气杆菌等革兰阴性菌也表现出抑制作用，具有较广的抑菌谱，为细菌素的研究与应用提供参考资料。