前胡总香豆素半仿生提取工艺优化

王 芳， 宋向文， 韩邦兴， 陈艳君， 陈乃东

(皖西学院 生物与制药工程学院 安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

前胡为伞形科前胡属植物白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn)的干燥根[1-2],主产于安徽、浙江、湖南、四川等地，是安徽宁国道地药材，其中安徽前胡药材产量居全国之最，市场占有率高达33%[3]。主治肺热痰郁，痰黄稠粘，咳喘痰多；哎逆食少；胸膈满闷等症[4]。近年研究发现，前胡在治疗心血管疾病、慢性呼吸衰竭、急性支气管炎、小儿间质性肺炎、慢性支气管炎以及白内障术后虹膜睫状体炎等方面[5-6]均有效，临床应用范围广，市场经济价值高。

现代研究表明，前胡所含有效成分包括香豆素类、菲醌类、有机酸类、甾醇类及挥发油类等化合物[7-8]，其中香豆素类成分药理活性显著，是《中国药典》中规定的检测指标性成分，且香豆素成分已在化工、保健、医药及食品等领域中广泛应用[9-11]。因此，香豆素类成分的提取、纯化、检测等研究工作的高效开展，是前胡扩大药源、创制新药、开发利用的重要途径[12]。半仿生提取法(Semi-bionic Extraction Method，SBE)[13]，是由利用控制论的“灰思维方式”提出的提取概念，模仿口服药物在胃肠道的转运过程，选定部分提取条件，以提取“活性混合体”[14-15]。采用半仿生-超声波辅助法对前胡总香豆素类化合物的提取进行试验研究，考察料液比、时间、乙醇浓度对总香豆素提取率的影响，以优化前胡中香豆素提取工具。

1 材料和方法

1.1 供试材料

前胡(采自安徽大别山区，由皖西学院宋向文老师鉴定为白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn.)；磷酸氢二钠和柠檬酸(西陇科学股份有限公司，分析纯)；无水乙醇(江苏强盛功能化学股份有限公司，分析纯)。

UV2300紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；FA1004电子分析天平(利辰科技有限公司)；KQ-200KDB高效率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-4C数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(巩义市英峪高科仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取指标成份7-羟基香豆素46.8 mg，转移至100 mL容量瓶中，无水乙醇定容，得0.468 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 半仿生溶液的配制 以磷酸氢二钠和柠檬酸调节提取溶液pH值，分别制成pH=2、7.6、8.3的缓冲溶液，备用[15-16]。

1.2.3 供试品溶液的制备 取干燥前胡药材适量，粉碎，过50目筛，准确称取约4.0 g 置于锥形瓶中，用pH=2.0的缓冲液在设定条件下提取，再依次用pH值7.6、8.3的缓冲液在相同的条件下各提取1次，过滤，合并滤液，浓缩，转移至25 mL容量瓶，冷却后无水乙醇定容。

1.2.4 检测波长的确定 将上述7-羟基香豆素溶液和供试品溶液在200～400 nm的波长下全波长扫描，结果如图1～2，二者均在324 nm处有最大吸收峰，检测波长选为324 nm。

1.2.5 标准曲线的建立 分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的7-羟基香豆素对照品溶液至10 mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，配成不同浓度的对照品溶液。于324 nm下测得吸光值，以7-羟基香豆素浓度(μg/mL) 为横坐标，吸光度为纵坐标，确定回归方程，结果：y=0.097 6x+0.055 9，r2=0.997 8。

图1 7-羟基香豆素紫外扫描图

图2 白花前胡紫外扫描图

1.2.6 总香豆素提取率的测定 设定紫外分光光度计检测波长324 nm，测定各样品峰面积，根据上述线性回归方程计算样品浓度，并计算前胡中总香豆素提取率：

式中，C为测得浓度(μg/mL)，V是供试品溶液体积(mL)，M为精密称取前胡粉的重量(g)。

1.2.7 方法学验证

1.2.7.1 精密度试验 精密吸取7羟基香豆素对照品溶液5 mL，定容于25 mL容量瓶中，吸取稀释后的对照品溶液按照测定条件测定5次，记录吸光度，计算得RSD=0.20%(n=5)，表明该仪器精密度良好。

1.2.7.2 稳定性试验 精密称取粉碎过筛后的白花前胡粉4.0 g，按照上述供试品的制备方法，得供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、48 h按照测定条件测定吸光度，计算得RSD=1.42%(n=7)，表明样品48 h内稳定。

1.2.7.3 重复性试验 精密称取4.0 g粉碎过筛后的白花前胡粉6份，按照上述供试品的制备方法，得供试品溶液6份，分别测定吸光度，计算总香豆素浓度，得各组总香豆素的RSD=1.91%(n=6)，表明该方法重复性好。

1.2.7.4 加样回收率试验 精密称取约4.0 g已知含量的白花前胡粉9份，分别加入“1.2.1”项下的对照品1 mL，按照供试品溶液的制备方法，得9份供试品溶液，照上述测定条件分别测定吸光度，计算总香豆素提取率，并计算加样回收率。平均加样回收率为97.44%，RSD=2.79%(n=9)，表明本试验加样回收率符合要求。

1.2.8 单因素试验

1.2.8.1 乙醇浓度对总香豆素提取率的影响 精密称取前胡粉末6份，每份约4.0 g，分别加入乙醇浓度为15 %、30%、45%、60%、75%、90%的半仿生提取液(pH=2)，设定料液比为1∶30，超声提取40 min，其余步骤按上述供试品制备方法操作，照上述测定条件分别测定吸光度，计算各组总香豆素提取率。

1.2.8.2 料液比对总香豆素提取率的影响 精密称取前胡粉末6份，每份约4.0 g，分别加入料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的半仿生提取液(pH=2)，设定乙醇浓度为60%，超声提取40 min，其余步骤按上述供试品制备方法操作，照上述测定条件分别测定吸光度，计算各组总香豆素提取率。

1.2.8.3 提取时间对总香豆素提取率的影响 精密称取前胡粉末6份，每份4.0 g，设定料液比为1∶30，加入60%乙醇的半仿生提取液(pH=2)，分别超声提取30、35、40、45、50、55 min，其余步骤按上述供试品制备方法操作，照上述测定条件分别测定吸光度值，计算各组总香豆素提取率。

1.2.9 正交试验设计 在单因素试验基础上，以前胡总香豆素提取率为评价指标，选用L9(34)正交表进行试验，通过Minitab 16.1.0软件作结果分析，优选半仿生提取的最佳提取条件。

1.2.10 工艺验证试验 精密称取前胡粉末3份，每份4.0 g，采用优化的工艺条件分别进行提取，测定总香豆素含量并计算其提取率。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对前胡总香豆素提取率的影响

由图3可知，前胡总香豆素提取率在一定范围内随着乙醇浓度的升高而升高，60%时提取率最高，继续增大乙醇浓度，提取率趋于平稳。故选取60%乙醇溶液为最佳乙醇浓度。

2.2 料液比对前胡总香豆素提取量的影响

由图4可知，料液比在10%～30%范围内，前胡总香豆素提取率逐渐增加，30%时达到最高值，再增加提取液反而会导致提取率下降。分析原因可能本试验为含有酸碱性的半仿生提取液，提取后需要进一步浓缩，加大提取液的比例，即加多溶剂体积，在浓缩过程中酸碱性增强，浓缩时间增加，导致香豆素类成分的结构会被破坏，损失量增加，致使提取率呈降低趋势。故最佳料液比确定为1∶30。

2.3 提取时间对前胡总香豆素提取量的影响

图3 乙醇浓度对前胡总香豆素提取率的影响

图4 液料比对前胡总香豆素提取率的影响

图5 提取时间对前胡总香豆素提取率的影响

由图5可知，30～45 min之间，提取率逐渐增加，提取时间达到45 min随着提取时间的递增前胡总香豆素的提取率下降。分析原因可能是香豆素类化合物过长时间的在仿生的酸碱性环境中，易被开环破坏，影响其共轭双键结构，导致检测的浓度降低，提取率下降。故选取45 min为最佳提取时间。

2.4 正交实验结果分析

以前胡总香豆素提取率为指标，根据单因素试验结果，选用L9(34)正交表进行试验优选方案设计，其中因素水平见表1，结果见表2～3。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

注：F0.05(2，2)=19.00。

表2中第5组A2、B2、C3的提取率最高，极差分析得到的最优组合为A2、B2、C3，直观分析和方差分析结果一致，影响因素主次顺序为料液比>提取时间>乙醇浓度。表3方差分析料液比对前胡总香豆素提取率的影响有显著意义(P<0.05)，提取时间和乙醇浓度没有显著意义，结合单因素试验结果，最终确定前胡总香豆素提取率最佳提取工艺条件为A2、B2、C2，即乙醇浓度为60%，料液比为1∶30，提取时间为45 min。

2.5 验证试验

表4 最佳提取工艺条件的验证结果

6次重复试验结果的平均提取率为5.13%(RSD=1.83%，n=6),与正交试验结果最高值相当，表明优化的工艺提取率较高，且工艺稳定、方法可行。

3 结论与讨论

试验从提取前胡中总香豆素的角度出发，在单纯超声波提取的基础上加入了半仿生原理以破坏细胞壁、加快有效成分溶出。最佳提取工艺为乙醇浓度60%，料液比为1∶30，提取时间为45 min。在最佳工艺条件下，前胡总香豆素的提取率平均可达5.13%，高于已有文献报道的提取率[16]。本方法操作简单可行，结果稳定，重复性好，对产业化开发前胡中的活性物质具有重要意义。

由于提取工艺不同，半仿生法提取的总香豆素与传统单纯超声波提取的总香豆素提取率有明显差异，表明两者之间具有不同的理化性质，两者的成分组成比例不同。不同的组成是否会造成活性差异，相关试验研究有待进一步考察。