循环肿瘤细胞检测在子宫内膜癌患者的临床意义

李玲霞,李 佳,刘淑娟,邹 伟,贺艳丽,吕小慧,吕艳红,詹 瑛,赵淑华,吴利英,谭明华,贺媛媛

(空军军医大学第一附属医院妇产科,西安 710032;#共同第一作者；*通讯作者,E-mail:455355316@qq.com)

子宫内膜癌为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,近年来发病率在世界范围内呈上升趋势。2015年中国约有63 400例新发病例和21 800例死亡病例[1];2017年美国大约有61 380例新发病例和死亡病例10 920例[2],与2016年相比,新发病例及死亡病例均有所上升[3]。肿瘤的病理类型、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴转移及子宫外病灶均会影响患者预后。而且,有6%-7%的子宫内膜局灶癌变且无淋巴结转移的患者在标准手术后仍有远处转移[4,5]。肿瘤标志物在恶性肿瘤的发生、发展中有着不可或缺的作用,但目前应用于子宫内膜癌个体化诊疗的肿瘤标志物仍然不多[6]。近年来,越来越多的研究证明,外周血中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)与恶性肿瘤的转移、复发以及不良预后密切相关[7-9]。因此,本研究通过分析56例子宫内膜癌患者的临床病理资料,探讨循环肿瘤细胞检测在子宫内膜癌中的临床意义,以期为子宫内膜癌患者诊治及预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析我院2016-01～2017-06收治的检测外周血CTC的子宫内膜癌患者56例,年龄38-71岁,平均年龄(51.84±8.13)岁。所有患者均行机器人辅助下全子宫或广泛全子宫+双附件切除+盆腔淋巴结清扫术,术后由临床病理医生诊断,确定病理类型及组织学类型。其中,子宫内膜样腺癌50例,子宫内膜样腺癌及透明细胞癌混合型1例,去分化子宫内膜样腺癌及肉瘤混合型1例,透明细胞癌2例,浆液性癌2例。

1.2 循环肿瘤细胞检测方法

采用imFISH平台检测技术行外周血CTC的检测。主要步骤包括:①采用阴性富集法收集循环肿瘤细胞:采集5 ml外周血,首先以650g离心5 min去除血浆,再利用低渗溶液进行红细胞裂解,之后进行抗CD45免疫磁珠孵育去除白细胞。②对剩余细胞杂交8号着丝粒探针,行CD45抗体免疫荧光染色。③用10 μl DAPI复染封片后,在荧光显微镜下观察全片、对阳性CTC细胞进行计数。

CTC阳性标准:DAPI标记细胞核,CD45标记白细胞,FISH信号≥3个且DAPI阳性、CD45阴性为阳性CTC细胞,CTC计数≥2个阳性CTC细胞视为阳性(见图1)。

图中为CTC、白细胞各一个(见箭头)，其中阳性CTC判断标准为DAPI+/CD45-/CEP8≥3个信号点；白细胞判断标准为：DAPI+/CD45+;蓝色：DAPI；橙色：CEP8；红色：CD45图1 CTC的免疫荧光染色Figure 1 Immunofluorescence staining of circulating tumor cells

1.3 CTC检测方案

患者均在手术前、后两个时间节点采取外周血5 ml行CTC检测:第1次采血时间为手术前1 d;为研究手术对CTC的影响,将第2次采血时间定为术后第4-5天,辅助治疗前。通过动态观察CTC变化,分析其与临床病理特征的关系。

1.4 统计学方法

使用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析,计量资料比较采用秩和检验,计数资料比较采用卡方检验和Fisher确切概率法,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC阳性率

术前56例患者均行CTC检测,其中有38例CTC阳性,阳性率为67.86%;术后因各种客观原因,有39例患者按时完成了术后CTC的检测,其中有27例CTC阳性,阳性率为69.23%。

2.2 CTC阳性率与临床病理特征的关系

术前CTC阳性率在不同浸润深度、病理类型、分化程度、淋巴转移及临床分期方面差异均无统计学意义(P>0.05);术后CTC阳性率在不同病理类型方面差异有统计学意义(P<0.05),腺癌患者的阳性率更高,而在不同浸润深度、分化程度、淋巴转移及临床分期方面,差异均无统计学意义(P>0.05,见表1)。

2.3 CTC水平与临床病理特征的关系

术前及术后在不同肌层浸润深度、淋巴转移及临床分期患者外周血CTC水平差异均有统计学意义(P<0.05),浸润深度越深,淋巴转移阳性、分期越晚,CTC水平越高;不同分化程度患者术前、术后CTC水平差异均无统计学意义(P>0.05);不同病理类型患者术前CTC水平差异无统计学意义,术后腺癌患者CTC水平高于其他病理类型患者,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表1 CTC阳性率与临床病理特征的关系

Table 1 Correlation between positive rates of CTCs and clinicopathological features

临床特征术前CTC术后CTC阴性阳性χ2P阴性阳性χ2P浸润深度0.110.740.161.00 <1/213291021 >1/25926病理类型0.160.657.310.02 腺癌1635927 其他2330分化程度0.120.941.930.42 低4956 中716312 高71349淋巴转移0.420.670.191.00 是3425 否15341022临床分期0.010.930.011.00 Ⅰ1532920 Ⅱ和Ⅲ3637

表2 CTC水平与临床病理特征的关系(个/5 ml)

Table 2 Correlation between CTC expression level and clinicopathological features(numbers/5 ml)

临床特征术前术后CTCtPCTCtP浸润深度3.58<0.0013.64<0.001 <1/25.78±2.173.58±0.98 ≥1/216.63±11.4817.29±12.13病理类型1.860.082.410.03 腺癌7.90±2.796.25±2.52 其他3.75±2.840.67±0.33分化程度1.340.221.450.16 低20.70±10.6613.09±8.05 中4.17±0.883.00±0.45 高3.00±0.903.08±0.89淋巴转移5.64<0.0014.58<0.001 是37.40±19.2620.43±12.07 否3.80±0.572.63±0.41临床分期3.74<0.0013.21<0.001 Ⅰ4.26±0.752.66±0.44 Ⅱ和Ⅲ24.71±40.1812.50±25.55

3 讨论

CTC是指由于自身脱落或其他原因从原发灶或转移病灶进入外周血循环、淋巴循环的肿瘤细胞。CTC技术应用于肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等实体恶性肿瘤的临床疗效评价及预后等已有研究报道[10]。而且,有研究结果提示CTCs能更早地反映疾病状态及判断疾病预后[11]。目前尚无确切的检测子宫内膜癌疾病状态、疾病进展及预后的方法。因此,有效发现外周血中的CTCs对子宫内膜癌的诊断、复发和预后的判断有重要意义。

本研究显示,56例子宫内膜癌患者,38例术前外周血CTC阳性,阳性率为67.86%,术后完成CTC检测的39例患者中有27例CTC阳性,阳性率为69.23%。CTC阳性率除术后在病理类型方面差异有统计学意义外,在其他方面术前术后差异均无统计学意义。外周血CTC水平术前及术后在肌层浸润深度、淋巴转移及临床分期方面差异均有统计学意义,浸润深度越深,淋巴转移阳性、分期越晚,CTC水平越高;在分化程度方面,术前、术后CTC水平差异均无统计学意义(P>0.05);在病理类型方面,术前差异无统计学意义,术后腺癌患者CTC水平要高于其他病理类型患者,差异有统计学意义。另外,有2例患者术前及术后CTC均异常升高,未纳入研究。1例为子宫内膜癌Ⅳ期,术前胸部CT提示双肺可见转移灶,最大直径约1.2 cm,术前CTC为95,术后CTC为89,术后病理提示子宫内膜低分化腺癌,侵及肌层近全层,右侧宫旁查见癌组织,盆腔淋巴结(5/18)阳性,其中腹主动脉旁可见转移淋巴结。另外1例为子宫内膜癌术后放化疗后3年半,复发,全身PET-CT提示中腹部腹膜后可见肿大淋巴结,我科行机器人辅助下复发病灶切除术,术后病理提示:低分化癌伴坏死,该患者术前CTC为70,术后为28。通过分析得知,分化程度越低,浸润深度越深,临床分期越晚,且发生淋巴结转移的患者CTC越高。这与Ni等[12]的研究结果基本相一致。

体细胞异倍体是肿瘤细胞最常见的特征,与肿瘤的发生、发展密不可分[13]。有报道提示,在某些实体瘤的肿瘤细胞中观察到非整倍体染色体8(Chr8),包括肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、食道癌和肝细胞癌等[14]。也有报道指出,8号染色体非整倍体的发生率随着子宫内膜疾病的严重程度而增加[15]。但是,有研究发现子宫内膜样腺癌最常见的染色体改变是染色体1和10的增加,而子宫内膜不典型增生最常见的是染色体1和17的增加[16]。故该技术在设计上可能存在一定缺陷。

循环肿瘤细胞的采集需要极其敏感和特定的方法,除imFISH技术外,目前临床上被广泛应用的主要还有：①美国强生的CellSearch系统,用上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体磁珠富集CTCs。深入研究该方法后发现,某些侵袭性肿瘤细胞在进行上皮间质转化(EMT)过程中,细胞基因表达谱特别是上皮抗原向间质性表型转变,此时癌细胞表面EpCAM表达下调[17]。因此,导致了以EpCAM为基础的CS富集效率不高,准确性降低。②ISET,该技术基于肿瘤细胞直径大于外周血白细胞直径的原理,应用膜滤过法的物理方法分离循环肿瘤细胞,不依赖于肿瘤分子表面的标记物。它可以最大程度保留肿瘤细胞原始信息,如形态学、分子生物学信息等。但是,很大一部分恶性肿瘤患者的原始肿瘤细胞是小细胞(细胞直径<白细胞直径)。有一项研究提示,在肝癌患者中,不论是术前还是术后采集到的CTC,其中70%均为小细胞[18],因此,应用此检测技术会丢失大量与临床研究相关的小细胞CTC,故此技术也有一定弊端[19]。

综上所述,本研究于国内首次提出:子宫内膜癌患者的CTC阳性率可能与病理类型有关,与浸润深度、分化程度、淋巴转移及临床分期无关,而CTC水平可能与肌层浸润深度、淋巴转移及临床分期有关。也有研究认为,子宫内膜癌CTC的阳性率及水平与临床病理特征无关。我们认为在将CTC检查纳入临床决策时,可能还需要更精确的技术支持、更多样本量收集和长期的随访。本课题组将通过样本量的进一步收集,更长的随访时间,使用更加精确的检测技术,对CTC检测在子宫内膜癌的临床意义进行更深入的研究。