miR-15a-5p对胃癌细胞增殖的影响

李玉龙,宗 伟,刘海玲,王 萍

(1陕西省人民医院消化内科,西安 710068;2西安交通大学第一附属医院儿科;*通讯作者,E-mail:liyulong0639@126.com)

胃癌(gastric cancer,GC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均位居恶性肿瘤前列,也是我国常见的病死率高的恶性肿瘤之一[1]。由于胃癌具有早期诊断率低、恶性程度高、病情进展快、预后差等特性,已成为威胁人类健康的严重疾病之一。因此,寻找胃癌早期分子标志物,探索胃癌发生发展过程中涉及的分子机制,寻找胃癌治疗的潜在靶点,对提高胃癌患者的诊断治疗具有重要意义。

miRNA是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA,通过与靶mRNA的序列碱基互补配对结合,抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的降解,从而对基因进行转录后调控[2,3]。在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤中,都发现有miRNA表达异常,例如microRNA-518在胃癌中低表达,过表达microRNA-518促进胃癌细胞MKN45和HGC27凋亡[4]。miR-1236-3p在胃癌中低表达,而过表达miR-1236-3p可以抑制胃癌细胞SGC-7901和MKN-45增殖,迁移和侵袭[5]。miR-199b-5p在宫颈癌中高表达,其通过靶向作用KLK10促进肿瘤生长和转移[6]。miR-96在肺癌中表达上调且miR-96的过表达可促进A549细胞的侵袭和迁移[7]。miR-15a在胃癌组织中低表达[8]。本研究通过CCK-8实验观察miR-15a-5p mimics及miR-15a-5p inhibitor对胃癌SGC-7901和BGC-823细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

SGC-7901和BGC-823细胞购自中科院上海细胞库,采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,放置于37 ℃,5%CO2培养箱中。

1.2 主要试剂

提取总RNA所用的Trizol裂解液购自Invitrogen公司、逆转录试剂盒、定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。miR-15a-5p mimics及mimics control由上海吉玛制药技术有限公司合成。miR-15a-5p mimics sense: 5′-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG-3′,miR-15a-5p mimics antisense: 5′-CAAACCAUUAUGUGCUGCUAUU-3′;对照序列sense: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。miR-15a-5pinhibitor及inhibitor control由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。miR-15a-5p inhibitor:5′-CACAAACCATTATGTGCTGCTA-3′,inhibitor control:5′-CAGTACTTTTGTGTAGTACAA-3′。

1.3 RT-PCR检测miR-15a-5p的表达水平

转染前1 d将SGC-7901和BGC-823细胞种入培养板,24 h后待细胞生长密度达到80%左右即可转染,根据脂质体Lipofectamine2000说明书分别将miR-15a-5p mimics,miR-15a-5p inhibitor序列及其各自对照转染至SGC-7901和BGC-823细胞。转染后24 h收集细胞,提取细胞RNA,分别利用miR-15a-5p特异性逆转录引物和U6引物进行逆转录,实时定量PCR实验检测miR-15a-5p的表达量,程序如下:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。

1.4 CCK-8实验检测miR-15a-5p对胃癌细胞增殖的影响

Lipofectamine2000转染试剂分别将miR-15a-5p mimics、mimics control、miR-15a-5p inhibitor、inhibitor control转染至SGC-7901和BGC-823细胞中,转染后24,48,72 h分别加入CCK-8,置于37 ℃培养箱中培养,2 h后用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 miR-15a-5p的转染效率

RT-PCR检测结果显示,与mimics control组相比,miR-15a-5p mimics转染组SGC-7901细胞中miR-15a-5p的表达水平显著升高(P<0.05);与mimics control组相比,miR-15a-5p mimics转染组BGC-823细胞中miR-15a-5p的表达水平显著升高(P<0.05,见图1)。

与mimics control比较,*P<0.05图1 miR-15a-5p mimics转染胃癌细胞后检测miR-15a-5p的表达Figure 1 The expression of miR-15a-5p after transfection with miR-15a-5p mimics in gastric cancer cells

2.2 miR-15a-5p inhibitor的转染效率

RT-PCR检测结果显示,与inhibitor control组相比,miR-15a-5p inhibitor转染组SGC-7901和BGC-823细胞中miR-15a-5p的表达水平有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。

2.3 miR-15a-5p表达对胃癌细胞增殖的影响

与mimics control组相比,miR-15a-5p mimics转染组SGC-7901细胞在转染后24,48,72 h细胞活力显著下降(P<0.05,见图3)。与mimics control组相比,miR-15a-5p mimics转染组BGC-823细胞在转染后24 h,72 h细胞活力显著下降(P<0.05,见图3)。说明miR-15a-5p可抑制胃癌细胞的增殖。

2.4 miR-15a-5p inhibitor对胃癌细胞增殖的影响

与inhibitor control组相比,miR-15a-5p inhibitor转染组SGC-7901细胞在转染后48 h细胞活力显著升高(P<0.05)。与inhibitor control组相比,miR-15a-5p inhibitor转染组BGC-823细胞在转染后48,72 h细胞活力显著升高(P<0.05,见图4)。说明miR-15a-5p inhibitor可促进胃癌细胞的增殖。

图2 miR-15a-5p inhibitor转染胃癌细胞后检测miR-15a-5p的表达Figure 2 The expression of miR-15a-5p after transfection with miR-15a-5p inhibitor in gastric cancer cells

与mimics control比较,*P<0.05图3 miR-15a-5p对胃癌细胞增殖的影响Figure 3 Effect of miR-15a-5p on the proliferation of gastric cancer cells by CCK-8

与inhibitor control比较,*P<0.05图4 miR-15a-5p inhibitor对胃癌细胞增殖的影响Figure 4 Effect of miR-15a-5p inhibitor on the proliferation of gastric cancer cells by CCK-8

3 讨论

miRNAs参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移侵袭等重要的生命过程。一个miRNA可以调节多个靶基因,一个基因也可能被多个miRNA调节。现有研究表明,miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关。miRNA在许多肿瘤中存在异常表达,提示其可能在癌症的发生发展中作为一种重要的生物标记[9]。在胃癌的发生发展过程中,miRNA可能发挥着癌基因或者抑癌基因的作用,发挥抑癌基因作用的miRNA过表达可以抑制胃癌的发展,为miRNA治疗胃癌提供理论基础。miR-15a-5p参与多种癌症的发生发展。已有研究报道,miR-15a-5p通过靶向作用BDNF抑制肝癌细胞的增殖及分裂[10]。miR-15a-5p在结直肠肿瘤中显著上调,且与预后相关[11]。miR-15a-5p通过靶向WNT3A抑制子宫内膜癌细胞生长[12]。

本研究将miR-15a-5p mimics转染至胃癌细胞,使miR-15a-5p在胃癌细胞中过表达,CCK-8实验结果表明miR-15a-5p过表达能够抑制胃癌SGC-7901和BGC-823细胞的增殖。将miR-15a-5p inhibitor转染至胃癌细胞,抑制miR-15a-5p在胃癌细胞中的表达,CCK-8实验结果表明抑制miR-15a-5p表达可促进胃癌SGC-7901和BGC-823细胞的增殖。本实验通过过表达miR-15a-5p及抑制miR-15a-5p表达两种方式,检测miR-15a-5p对胃癌细胞增殖的影响,结果提示miR-15a-5p可能在胃癌细胞的增殖过程中发挥抑癌基因的作用。