秦岭地区北柴胡指纹图谱

张 威， 刘玉梅， 吕秉鼎， 刘峻麟， 朱月健， 曹 勇， 韩荣春， 俞年军∗

（1. 安徽中医药大学药学院， 安徽 合肥 230012； 2. 安徽普仁中药饮片有限公司， 安徽 亳州 236800；3. 安徽济人药业有限公司， 安徽 亳州 236800）

柴胡为我国常用中药， 原名茈胡， 始载于《神农本草经》， 列为上品， 《本草纲目》 中记载“茈胡生山中， 嫩则可茹， 老则采而为柴”， 故其苗有茹草之名， 其根有柴胡之名。 2015 年版《中国药典》 中记载， 柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根， 有“北柴胡” 和“南柴胡”之分[1］， 具有解热、 抗病毒、 降血脂、 保肝、 抗炎、 抗肿瘤等作用[2-4］， 主要分布于华北、 东北、 华东、 华中一带，资源量较大。 柴胡为我国传统大宗中药材， 随着国家对中医药的保护， 其用量日益增加， 野生资源遭到严重破坏，较上世纪70 年代下降约1／2[5］， 当前市场流通以栽培品为主。 柴胡化学成分复杂， 含有皂苷、 黄酮、 挥发油、 多糖等多种成分[6-8］， 不同产地、 生长方式、 采收加工方式等可使其有效成分含有量有所差异[9-10］， 导致质量难以有效控制， 仅以药典规定的柴胡皂苷a、 d 的含有量作为指标不足以全面评价其质量优劣[11-14］， 而中药指纹图谱能从整体上分析， 可为该中药质量评价提供依据[15］。

秦岭山脉西起甘肃南部， 经陕西南部、 山西南部， 东至河南西部， 被认为是柴胡的主产区， 本草记载柴胡“以银州者为胜”， 则说明了秦岭地区柴胡的道地性。 秦岭地区作为柴胡道地产区及主产区， 目前研究较少， 且对柴胡指纹图谱的研究局限于不同品种及产地， 对不同生长方式间指纹图谱研究相对较少[16-19］。 前期对甘肃、 陕西、 山西调研发现， 3 个省均具有较大规模的北柴胡种植， 栽培品大多采用野生种栽培， 且发现不同产地之间存在相互引种的现象， 因此本实验针对秦岭地区不同产地及不同生长方式的北柴胡进行指纹图谱研究， 以探究其质量差异性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱仪， 配置G7111A 四元泵、 G7129A 自动进样器、 G7114A 紫外检测器（美国Agilent 公司）； CP225D 型电子天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）； HH-4 型数显恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂）； AS 系列超声清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）； 竑力HL-200A 型高速多功能打粉机（上海赛耐机械有限公司）； Cascada III. I 10 型纯化水系统（颇尔过滤器（北京） 有限公司）。

1.2 试剂 柴胡皂苷a （批号DST180210-006， 含有量≥98%）、 柴胡皂苷c （DST170330-007， 含有量≥99%）、 柴胡皂苷d （批号DST170801-008， 含有量≥98%） 对照品均购于成都德思特生物技术有限公司。 乙腈 （批号AC-10841124， 色谱纯）、 甲醇（批号Me-00040203， 色谱纯）购于瑞典Oceanpak 公司； 纯化水（自制）； 磷酸（天津永大化学试剂有限公司， 色谱纯）； 氨水等其余试剂均为分析纯。

1.3 药材 北柴胡采自甘肃、 陕西、 山西， 信息见表1，经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定为正品。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Topsil HPLC C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脱（0～5 min， 15% ～25% A； 5 ～40 min， 25% ～55%A； 40～55 min； 55% ～60% A； 55～65 min， 60% ～75% A；65～75 min， 75% ～85% A； 75～85 min， 85% ～90% A）； 柱温30 ℃； 体积流量1.0 mL／min； 检测波长210 nm； 进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取柴胡皂苷a 1.87 mg、 柴胡皂苷c 0.76 mg、 柴胡皂苷d 1.28 mg， 置2 mL 棕色量瓶中， 甲醇溶解， 定容， 摇匀， 即得， 过滤备用。

表1 样品信息

2.2.2 供试品溶液 取药材粉末（过4 号筛） 约0.5 g，精密称定， 置具塞锥形瓶中， 加入含5% 浓氨试液的甲醇25 mL， 密塞， 30 ℃超声 （功率200 W、 频率40 kHz）30 min， 过滤， 用20 mL 甲醇分2 次洗涤容器及药渣， 洗液与滤液合并， 水浴挥干， 残渣加甲醇溶解， 转移至5 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 过滤， 取续滤液， 即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品S1， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次， 记录液相色谱图， 测得各共有峰相对保留时间、 相对峰面积RSD 均分别小于0.65%、 1.91%， 表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 精密称定同一批药材粉末6 份， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 记录液相色谱图， 测得各共有峰相对保留时间、 相对峰面积RSD 均分别小于0.93%、 2.55%， 表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下于0、 2、 4、 6、 8、 12 h 进样测定， 记录液相色谱图， 测得各共有峰相对保留时间、 相对峰面积RSD 均分别小于1.21%、 2.87%， 表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4 指纹图谱建立 取药材粉末（过4 号筛）， 精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 记录液相色谱图。

2.4.1 共有峰确认 将24 批样品色谱图AIA 文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 版）， 进行共有峰数据处理， 设置S1 为参照指纹图谱， 多点校正匹配， 得到24 批样品HPLC 指纹图谱和色谱图， 见图1 ～2。 共标定出12 个共有峰， 其中2 号峰为柴胡皂苷c， 4 号峰为柴胡皂苷a， 7 号峰为柴胡皂苷d， 由于4 号峰峰面积较大， 分离度较好， 故选择其作为参照峰， 各共有峰相对保留时间及相对峰面积见表2～3。

图1 24 批样品HPLC 指纹图谱

表2 24 批样品共有峰相对保留时间

表3 24 批样品共有峰相对峰面积

图2 各样品HPLC 色谱图

2.4.2 相似度分析 将24 批样品色谱图AIA 文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 版）， 进行相似度评价， 见表4。 可知24 批样品与参照图谱比较， 相似度均在0.920～0.989 之间， 表明不同产地、 生长方式样品的质量相对稳定。

表4 24 批样品相似度

2.4.3 聚类分析 将24 批样品的12 个共有峰峰面积数据导入SPSS 23.0 软件进行聚类分析， 以平方欧式距离为各样品间相似度距离， 采用质心聚类的方法对数据进行分析，见图3。 24 批样品被分为2 大类， 其中S2 ～S4、 S6、 S9 ～S10、 S13、 S18 聚为一类， 其他样品聚为一类； S1 ～S3 为山西省野生品， S4～S8 为山西省栽培品， S9～S12 为陕西省野生品， S13～S16 为陕西省栽培品， S17 ～S21 为甘肃省野生品种， S22～S24 为甘肃省栽培品种， 表明不同产地、 不同生长方式间北柴胡样品质量较近， 推测可能与栽培品多采用野生种种植有关。

图3 24 批样品聚类树状图

2.4.4 主成分分析 对12 个共有峰进行主成分分析， 将数据导入SPSS 23.0 软件， 得出各共有峰方差贡献表， 见表5。 12 个共有峰中得到4 种主成分， 第一主成分贡献率为42.209%， 第二主成分贡献率为24.701%， 第三主成分贡献率为13.195%， 第四主成分贡献率为8.349%， 4 种主成分累积贡献率达88.453%， 即该4 种主成分能反映药材基本信息。 将共有峰面积数据导入SIMCA 14.1 软件进行主成分分析， 结果见图4， 显示4、 7、 10、 12 号峰得分较高，与表5 结果一致， 4 种主成分为4、 7、 10、 12 号峰， 其中4 号峰为柴胡皂苷a， 7 号峰为柴胡皂苷d， 10 号峰与12 号峰未知。 图5 显示， 样品S3、 S6、 S9、 S10、 S13、 S18 为一类， 其他为一类， 与聚类分析结果基本一致。

表5 共有峰总方差

图4 24 批样品共有峰得分图

图5 24 批样品PCA 得分图

3 讨论与结论

本实验对不同流动相（甲醇-水、 甲醇-0.1%磷酸、 乙腈-水、 乙腈-0.1% 磷酸） 进行考察， 发现以乙腈-0.1% 磷酸洗脱时， 色谱图分离度及峰形较好， 故以其为流动相。同时， 检测波长选择2015 年版《中国药典》 中的210 nm。

本实验确定了12 个共有峰， 经对照品指认， 2 号峰为柴胡皂苷c， 4 号峰为柴胡皂苷a， 7 号峰为柴胡皂苷d。 主成分分析显示， 共有峰中4 个主成分方差累积贡献率达到88.453%， 分别为4 号峰、 7 号峰、 10 号峰（未知）、 12 号峰（未知）， 从一定程度上说明了《中国药典》 以柴胡皂苷a、 d 作为质量评价依据的合理性； 相似度分析显示， 24批样品与参照图谱的相似度均在0.920～0.989 之间， 表明各批药材质量相对稳定； 聚类分析结果分为2 大类， S2、S3、 S4、 S6、 S9、 S10、 S13、 S18 聚为一类， 其他样品聚为一类。 24 批不同产地、 生长方式下北柴胡的质量较稳定，栽培品与野生品可聚为一类， 一定程度上前者可替代后者，为野生转家种的推广提供参考。