HPLC-DAD-ESI-TOF／MS 法分析安神补脑液中化学成分

2019-06-01程素盼张敏敏张贵民苏瑞强耿岩玲赵恒强

中成药 2019年4期

程素盼，张敏敏，梁琰，张贵民，苏瑞强，耿岩玲，王晓∗，赵恒强∗

[1. 山东中医药大学药学院，山东济南250355； 2. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南250014； 3. 山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018； 4. 鲁南制药集团股份有限公司，中药制药共性技术国家重点实验室，山东省中药制药新技术重点实验室，山东临沂276006］

安神补脑液由淫羊藿、制何首乌、鹿茸、干姜、甘草、大枣、维生素B1 通过现代工艺精制而成，具有安神健脑、生精补髓、益气养血的功效，临床上常用于治疗肾精不足、气血两亏所致头晕、乏力、健忘、失眠、神经衰弱等症状[1-3］， 2015 版《中国药典》一部采用HPLC 法测定淫羊藿中淫羊藿苷、西药维生素B1 的含有量来对其进行质量控制[3］，也有一些报道采用相同方法测定其中1、 2种成分的含有量[4-9］。但安神补脑液为中药复方制剂，是通过多味中药中活性成分的协同作用来发挥药效，上述方法并不能全面反映其整体质量。

近年来，色谱与质谱联用技术发展迅速，因其分离度好、灵敏度高、分析周期短等优点被广泛应用于中药复方制剂的检测分析，特别是高分辨飞行时间（TOF／MS）质谱技术能给出化合物的精确分子量信息，从而进一步推断出分子式，可在没有对照品的情况下结合参考文献和数据库等进行初步鉴别[10］。因此，本实验建立高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱（HPLC-DAD-ESITOF／MS）法[11-14］分析安神补脑液中化学成分。

1 材料

1.1 仪器华谱S6000 高效液相色谱仪，配置自动进样器、四元泵、柱温箱、二极管阵列检测器；Agilent 6520 Q-TOF 液质联用仪（美国Agilent Technologies 公司）；电子分析天平（十万分之一，德国Sartourius 公司）； SB-5200D 高功率数控超声波仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药维生素B1 （批号SLBG9 093 V）、甘草苷（批号P25J7F18328）、 2， 3， 5， 4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷（批号P25D5S1）、淫羊藿苷（批号 T09N6B5664 ）、大黄素（批号P19A7F13264）对照品（含有量大于98%，上海源叶生物科技有限公司）；次黄嘌呤（批号F20100102）对照品（含有量大于98%，国药集团化学试剂有限公司）；甘草酸、 6-姜辣素（自制，含有量大于98%）。安神补脑液（鲁南厚普有限公司生产）于2016 年购自济南市各大药店，批号07115003、 00816047、 00815055、 00816028、07115006、 07115019、 00816002、 00816123、00816103、 00816058，编号S1 ～S10。乙腈为色谱纯（美国Fisher Scientific 公司）；甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司）；甲酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；无水乙醇为分析纯（天津市广成化学试剂有限公司）；水为密理博超纯水（18 MΩ）。

2 方法与结果

2.1 成分分析

2.1.1 供试品溶液制备取适量安神补脑液（编号S1）摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.2 对照品溶液制备精密称取维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、大黄素对照品各1.0 mg，置于1 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配成1 mg／mL 贮备液，各精密吸取适量于2 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制成含500 μg／mL 维生素B1、 100 μg／mL次黄嘌呤、 200 μg／mL 甘草苷、 200 μg／mL 二苯乙烯苷、300 μg／mL 淫羊藿苷、 100 μg／mL 甘草酸、100 μg／mL 6-姜辣素、 100 μg／mL 大黄素的溶液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液制备按处方比例及2015 版《中国药典》一部规定的工艺，分别制备缺维生素B1、淫羊藿、制何首乌、鹿茸、甘草、干姜的阴性样品，按“2.1.1” 项下方法制备，即得。

2.1.4 色谱条件 Waters XELECTTM HSS T3 色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相乙腈（A） -0.4%甲酸（B），梯度洗脱，程序见表1；柱温25 ℃；检测波长278 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 质谱条件流动相采用三通分流至0.4 mL／min；电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m／z 100～1 000；毛细管电压4.0 kV；喷雾气压310.28 kPa；干燥气体积流量10.0 L／min，温度325 ℃；裂解电压100 V；锥孔电压60 V。

2.1.6 ESI-TOF／MS 鉴别采用ESI-TOF／MS 技术对各成分色谱峰峰进行鉴别，根据其精确分子量信息、 DAD 检测器所得紫外吸收信息、前期相关文献、中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库来进行鉴别，推断出可能的分子式，并与相应对照品进行比较以保证准确性。结果见表2。

2.2 含有量测定

2.2.1 线性关系考察将“2.1.2” 项下对照品溶液稀释成不同质量浓度，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定。以成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，然后将溶液稀释至低质量浓度，以3 倍信噪比为检出限， 10 倍信噪比为定量限，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验取供试品溶液（编号S1），在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定6 次，测得维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、大黄素保留时间RSD分别为0.32%、 0.14%、 0.29%、 0.31%、 0.20%、0.09%、 0.09%、 0.06%，峰面积 RSD 分别为1.05%、 1.90%、 3.50%、 2.31%、 1.29%、 4.71%、1.84%、 3.92%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验取样品（编号S1） 6 份，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，测得维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、大黄素保留时间RSD 分别为0.33%、 0.24%、 0.45%、0.46%、 0.27%、 0.14%、 0.12%、 0.12%，峰面积RSD分别为 1.89%、 2.56%、 3.38%、 2.87%、 3.90%、4.52%、 2.08%、 2.72%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验取供试品溶液（编号S1），在“2.1.4” 项色谱条件下于0、 4、 8、 16、 24 h进样测定，测得维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、大黄素保留时间RSD 分别为0.32%、 0.81%、 0.31%、0.38%、 0.14%、 0.09%、 0.12%， 0.65%，峰面积RSD 分别为3.21%、 2.72%、 3.54%、 2.10%、3.76%、 4.52%、 4.06%、 2.72%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

表2 各成分ESI-TOF／MS 鉴别结果Tab.2 Results of ESI-TOF／MS identification of various constituents

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.5 加样回收率试验精密量取含有量已知的样品（编号S1） 1 mL，共6 份，精密加入各对照品适量，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，测得维生素B1、次黄嘌呤、甘草苷、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、大黄素平均加样回收率分别为96.50%、 94.29%、 95.94%、 97.48%、 91.10%、 95.27%、91.47%、 107.50%， RSD 分别为 2.78%、 6.36%、6.64%、 2.43%、 3.91%、 5.01%、 4.60%、 4.91%。

2.2.6 样品含有量测定按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（μg／mL）Tab.4 Results of content determination of various constituents （μg／mL）

3 讨论

3.1 指标成分选择安神补脑液为《金匮要略》收载的养心安神名方甘麦大枣汤的加减方[6］，方中制何首乌补肝肾，益精血，起养心安神之效[15］；鹿茸富含磷脂、氨基酸等营养物质，在消除疲劳、增强免疫力的同时可改善睡眠质量[16］；淫羊藿具有补肾壮阳、强筋健骨功效[16］；干姜温中散寒，具有养心、延长睡眠时间的作用[17］；甘草调和诸药。 2015 年版《中国药典》中制何首乌、淫羊藿、干姜、甘草含有量测定指标分别为二苯乙烯苷和蒽醌（大黄素）、淫羊藿苷、 6-姜辣素、甘草苷和甘草酸，而且维生素B1 具有维持神经正常的功能，《中国药典》也将其列入[3］，同时次黄嘌呤也是鹿茸抑制单胺氧化酶的有效成分[18］。最终，选择以上8 种成分作为安神补脑液含有量测定的指标成分。

3.2 色谱柱选择本实验比较了Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、 Waters XELECTTM HSS T3 （3.0 mm×150 mm， 3.5 μm）色谱柱，发现后者对安神补脑液中各成分的分离效果较好。

3.3 流动相选择本实验比较了甲醇-水、乙腈-水流动相，发现后者分离效果较好，而且峰数多，基线平稳，同时由于安神补脑液所含成分比较复杂，等度洗脱难以进行有效分离，故采用梯度洗脱。然后，本实验又向流动相中加入不同体积分数（0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.6%）甲酸，发现0.4%甲酸能较好地改善拖尾现象，并且峰形尖锐。

3.4 柱温、体积流量选择本实验调节柱温20、25、 35 ℃，发现25 ℃下各成分色谱峰分离度和峰形较好。安神补脑液中维生素B1 极性很大，出峰时间过快，受其他极性成分的影响较明显，文献[9］报道，流动相中加入盐可延缓该成分出峰时间，而本实验采用初始低体积流量的方法也实现了较好分离，并且操作简便易行。

3.5 检测波长选择本实验通过紫外检测器对样品进行全波长（190～400 nm）扫描，发现278 nm处各成分色谱峰峰形良好，基线稳定。