UPLC-MS/MS测定食品中18种非食用色素的研究

唐俊，曾凯，刘志斌

（1.南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330096；2.南昌市食品安全检测与控制重点实验室，江西 南昌 330096）

工业染料具有高毒、致畸、致突变等危害[1-2]，被明令禁止在食品中使用。辣椒酱颜色鲜艳，色素含量高，是可能违法使用工业染料的高风险产品。我国现行非食用色素检测标准一般只检测一种或少数几种，这些标准[3-5]还存在难适用复杂基质食品、试剂消耗量大、效率低等问题。因此，建立一次性检测多种非食用色素，才能对食品中添加非食用色素的违法行为进行有效的监控。

QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）方法是近年来国际上发展起来的一种快速样品前处理技术，由美国农业部于2003年开发的，最初用于农药残留的检测[6]。原理与高效液相色谱和固相萃取相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。QuEChERS 方法与传统方法比较具有回收率高、精确度和准确度高、可分析的农药范围广、分析速度快、溶剂使用量少，污染小，价格低廉、操作简便等优势，越来越多的替代传统液液萃取、固相萃取、凝胶渗透净化等前处理方法[7-10]。

本研究建立一套基于QuEChERS-液质联用同时分析辣椒酱中的18种非食用色素（罗丹明B、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、苏丹红I～IV、苏丹红G、苏丹橙G、结晶紫、隐色结晶紫、甲苯胺红、分散红1、分散橙3、分散黄3、碱性橙II、碱性嫩黄O、碱性红2）的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

1290-6460 超高效液相三重四级杆质谱联用仪：Agilent 公司；XS205 DualRange 十万分之一天平：Mettler Toledo 公司；TDL-5 离心机：上海安亭科学仪器厂。

罗丹明 B（95.0%）、孔雀石绿（95.0%）、隐色孔雀石绿（98.0%）、苏丹红Ⅰ（95.0%）、苏丹红Ⅱ（90.0%）、苏丹红Ⅲ（85.0 %）、苏丹红 G（90.0 %）、碱性橙 II（98.0 %）、碱性嫩黄 O（80.0%）、隐色结晶紫（98.0%）、无水硫酸镁、氯化钠、C18（硅胶）吸附剂：上海安谱实验科技股份有限公司；分散橙3（95.0 %）、分散黄3（99.0%）、碱性红 2（93.4%）、苏丹红Ⅳ（99.0%）、苏丹橙G（98.6 %）、甲苯胺红（68.0 %）：Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；结晶紫（90%）：Alfa Aesar 公司；分散红 1（95%）：ALDRICH 公司；甲醇、乙腈：色谱纯，Merck 公司；乙酸铵、甲酸：99 %，LCMS/HPLC，ANROUR CHEMICALS SUPPLY 公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量各色素标准品，用乙腈溶解，得到浓度为100 mg/L 的标准储备液，避光于4℃下保存。使用时用乙腈稀释成 10、20、40、80、120、200 μg/L 的混合标准工作液。

1.3 样品处理

准确称取5.0g 样品于50mL 离心管中，加入10 mL水，涡旋2 min，加入10 mL 乙腈和1 g 氯化钠涡旋提取 2 min，5 000 r/min 离心 5 min。取 2 mL 上清液，加入到装有50 mg C18和100 mg 无水硫酸镁的5 mL 离心管中，涡旋1 min，8 000 r/min 离心 5 min，含油脂样品于-20℃冷冻2 h，取乙腈层过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜，滤液供超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测。

1.4 液相色谱串联质谱条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：Eclipse-plus C18（3.0×150 mm，1.8 μm）；进样量：10 μL；柱温：40℃；流速：0.3 mL/min；流动相：A：5 mmol/L 乙酸铵-0.1%甲酸混合水溶液，B：甲醇；梯度洗脱条件见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源：ESI 正模式；雾化气：氮气；雾化气压力：0.28 Pa；离子喷雾电压：4 500 V；干燥气温度：350℃，干燥气流速：11 L/min；电子倍增器电压：200 V。18种色素质谱分析条件见表2。

表1 液相梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

表2 18种非食用色素质谱分析条件Table 2 MS parameters of 18 non-edible pigments

续表2 18种非食用色素质谱分析条件Continue table 2 MS parameters of 18 non-edible pigments

2 结果与分析

2.1 净化条件的优化

QuEChERS 技术常用的吸附剂有N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18（硅胶）、石墨化碳（graphitizable carbon，GCB），由于这些色素都具有六元环结构，极易被GCB 吸附，因而不能用其作为净化吸附剂。综合前期试验及文献，选定C18作为本试验吸附剂，通过比较用量为25、50、100 mg C18的净化效果和目标物回收率水平，确定50 mg C18为最佳用量。以空白辣椒酱为基质，添加量为200 μg/kg，两次平行试验取平均值，各吸附剂用量的回收率结果见表3。

表3 吸附剂用量对回收率的影响Table 3 Effect of adsorbent dosage on recovery rate

2.2 质谱条件的优化

液质联用法较液相色谱法更加灵敏，且可以同时实现多种化合物的高通量检测。以浓度为1 mg/L 的色素单标做为待测物，进样量为10 μL，目标物不经过色谱柱直接进入质谱，首先对目标物进行全扫描，确定每种色素的电离方式和分子离子峰；然后再运用子离子扫描模式将母离子打碎对子离子进行扫描，优化裂解电压和碰撞能量，选取两个丰度比较高的子离子分别作为定性和定量离子；最终建立的18种色素的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式的最佳质谱条件（见表2）。根据各色素保留时间的不同，将其分为4组进行数据采集，以保证所检测的各化合物都有足够的数据采集点，从而提高MRM 信号的响应强度。18种色素的MRM 谱图见图1。

图1 18种非食用色素的MRM 谱图Fig.1 MRM spectra of 18 non-edible pigments

2.3 方法的线性范围、检出限、定量下限、回收率与精密度

用空白基质提取液配制不同浓度的混合标准系列，以选定的定量离子峰面积Y 对含量X（μg/L）作标准曲线，18种非食用色素的线性范围及相关系数见表2。同时用空白基质提取液继续稀释混合标准系列的最低点，直到获得 3 倍（S/N=3）、10 倍（S/N=10）信噪比浓度，确定其为该非食用色素的检出限和定量限，见表4。

添加2个不同浓度水平的混合标准溶液，每个浓度水平取5 份样品进行试验，计算平均回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表 4。由表4可以看出，18种非食用色素的回收率为80.2%～109.2%，RSD 为2.4%～9.7%。

表4 18种非食用色素的线性范围、相关系数、检出限、定量限、回收率和相对标准偏差（n=5）Table 4 Linear ranges，correlation coefficients，litmits of detection，litmits of quantiflcation，recoveries and relative standard deviations of 18 non-edible pigments（n=5）

3 结论

本研究解决目前国内缺乏同时测定多种非食用色素方法的问题，建立了一次性检测辣椒酱中18种非食用色素的有效方法。本方法与传统方法相比检验时间缩短50%以上，试剂消耗减少50%以上，具有简单高效、快速准确、环境友好的优势，满足辣椒酱中非法添加非食用色素的实际监测的分析需求。