北五味子中总木脂素类成分的抗氧化及抗炎活性研究

马莹慧，冯波，朱鹤云，郭淑英，张慧锋，于欢

（吉林医药学院 药学院，吉林 吉林 132013）

五味子属木兰科植物，是传统中药材，主要产地为东北三省。五味子性温、味酸、甘、有益气生津、收敛固涩、补肾宁心、保护脑神经细胞、抗肿瘤等功能。对久泻不止、久嗽虚喘、短气脉虚、心悸失眠等症均有良好治疗作用[1]。五味子醇提物主要含有木脂素、多种油性成分、多糖、全氮及氨基酸等成分，其中木脂素类为主要活性成分，为一种天然化合物，具有抗氧化、保肝、抗炎等作用[2-5]。例如苑广信利用过氧化氢诱导氧化损伤的胰岛细胞RINm5F 为模型，通过噻唑蓝比色法（hiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、检测细胞内和培养液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（model driven architecture，MDA）含量来研究五味子提取物的抗氧化活性及机制，结果显示五味子提取物对胰岛细胞有增殖作用，并呈剂量依赖性；五味子提取物还对过氧化氢诱导氧化损伤的胰岛细胞有保护作用，通过与模型组对比，显示其具有浓度依赖性的抗氧化保护作用；当五味子提取物高时、中剂量组培养液和细胞内MDA 含量明显减少、SOD活力明显增强，说明细胞的抗氧化能力增强[6]。姚莹等采用四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝损伤模型，比较了南、北五味子中木脂素对小鼠血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）活性及肝组织匀浆MDA 水平的影响，并同时观察肝组织病理学改变。结果发现南、北五味子中木脂素均能明显降低急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST含量，降低肝组织MDA 的水平，肝脏病理损伤有明显的改善[7]。本试验选取5种木脂素成分对照品作为定量指标，对五味子中木脂素化合物进行纯化，并研究其抗氧化、抗炎作用及机制，为今后更深一步的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪：日本岛津公司；Rotavapor R-3 旋转蒸发仪：瑞士步琦有限公司；98-1-C型数字控温电热套：天津市泰斯特仪器有限公司；Scientz-12SN 冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800 型紫外分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；T-100 酶标仪：美国伯乐公司；Heal ForceHF90 CO2培养箱：上海力新仪器有限公司。

1.2 试剂及材料

北五味子：市售；五味子醇甲（Y17M8H31887）、五味子醇乙（P28S6F3984）、五味子酯甲（SO1030KA12）、五味子甲素（Z21A8B34395）、五味子乙素（P29J8066）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇（分析纯）：江苏汉邦科技有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Tedia 公司；HPD100型树脂：东鸿化工有限公司；一氧化氮（NO）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒：南京建成生物工程研究所；VC对照品：上海源叶生物科技有限公司；邻苯三酚：天津市大茂化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；溴化噻唑蓝四氮唑：普洛麦格生物科技有限公司；二甲基亚砜、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美国 Sigma；胎牛血清、青霉素链霉素双抗、DMEM 培养液：美国Gibco；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-10（Interleukinin-10，IL-10）试剂盒：武汉博士德生物园工程有限公司。

1.3 五味子总木脂素类化合物提取纯化方法

取干燥的五味子粉碎成粗粉，过40 目筛，晾干，称重。采用8 倍量95%乙醇回流提取2 次，每次提取1 h。合并两次提取液，抽滤，将滤液利用旋转蒸发浓缩，回收乙醇，加入适量蒸馏水制成浓度为0.15 g/mL 五味子总木脂素提取液。以HPD100 大孔吸附树脂纯化北五味子总木脂素类化合物，上样量为7 BV，吸附流速和洗脱流速均控制在2 BV/h，径高比为1∶6，洗脱溶剂为95%乙醇，洗脱量为11 BV，洗脱液利用旋转蒸发浓缩，回收乙醇后冷冻干燥得固体粉末，即为五味子总木脂素类化合物。

1.4 五味子总木脂素类化合物样品浓度测定

LC-20AT 型高效液相色谱系统，色谱柱为Diamonsil C18（5 μm，250 mm× 4.6 mm），柱温 30℃，进样量10 μL，体积流量1.00 mL/min，检测波长为254 nm，流动相为 A（乙腈）-B（水），梯度洗脱程序为：0～10 min，20 %～60 % A；10 min～15 min，60 %～61 % A；15 min～20 min，61 %～62 % A；20 min～25 min，62 %～63 % A；25 min～30 min，63 %～64 % A；30 min～35 min，64 %～65 %A；35 min～40 min，65%～70%A；40 min～45 min，70%～75%A；45 min～55 min，75%～80%A。

精密称取五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素、乙素对照品适量，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成含五味子醇甲浓度为0.1 mg/mL、醇乙浓度为0.05 mg/mL、酯甲浓度为0.05 mg/mL、甲素浓度为0.05 mg/mL、乙素浓度为0.05 mg/mL 的对照品混合溶液，备用。精密吸取五味子对照品混合溶液适量，配置成系列对照品溶液，以质量浓度（X）-峰面积（Y）进行线性回归，得到5种木脂素对照品的标准曲线。精密吸取五味子总木脂素类化合物样品溶液置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，经有机滤膜（0.45 μm）过滤后测定浓度。

1.5 抗氧化活性的研究

1.5.1 样品溶液的制备

精密称定提取纯化后的五味子总木脂素类化合物冻干粉末适量，分别配制成浓度为0.05、0.1、0.2 mg/mL的样品溶液各1 mL；精密称取VC对照品1 mg，配制成浓度为0.2 mg/mL 的对照品溶液。

1.5.2 总抗氧化能力的测定

按照T-AOC 试剂盒的总抗氧化能力测定操作步骤进行测定，分别配制样品管、对照管、VC对照管的待测溶液。采用紫外分光光度法，用蒸馏水调零，在520 nm 处测定各溶液吸光度值，并与同等浓度的VC对照品进行对照[8]。

式中：ODT为测定 OD 值；ODC为对照 OD 值。

1.5.3 对超氧阴离子自由基清除作用的考察

分别设定空白管、对照管、VC对照管和浓度分别为 0.2、0.1、0.05 mg/mL 的高、中、低浓度样品组。空白管和对照管均加入4 mL 蒸馏水，VC对照管加入4 mL已知浓度的VC对照品溶液，样品组分别加入各自浓度样品溶液4 mL。再向各管中加入0.1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸 [Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-Hcl]缓冲溶液（pH=8.2）4.5 mL，放入温度为25℃的水浴锅中传温20 min，除空白管外其余各管分别加入0.5 mL 3 mmol/L 的邻苯三酚溶液，空白管以同体积蒸馏水代替，振摇后马上在320 nm 处测定吸光度值，调零用空白管，每30 s 测一次，4 min 时停止。将所得数据横坐标用t 表示，纵坐标用An 表示做回归方程，得到的直线斜率Vx 即为反应速率[9-10]。

式中：V对照为邻苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V样品为邻苯三酚自氧化速率，ΔA/min；V对照回归方程为Y=0.061 4x+0.056 4。

1.6 抗炎活性的研究

1.6.1 炎症细胞模型的建立

首先利用MTT 法确定最大给药浓度，将RAW264.7 细胞按 1×105/mL，200 μL/孔接种于 96 孔板中，接种细胞总数为2×104个/孔，置于CO2培养箱中，温度37℃，CO2浓度5%，培养48 h，弃去细胞培养液，加入含有不同终浓度的含药（总木脂素纯化物、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素）DMEM 培养液 200 μL，空白组只加 DMEM 200 μL，各组均设置5个复孔，培养2.5 h，弃去细胞培养液，每孔加 1.0 mg/mL 的 MTT 100 μL 培养 4 h，弃去 MTT，每孔加 DMSO100 μL 振摇 20 min，在 570 nm 处测定吸光度值，计算抑制率。

抑制率 IC/%=（1-OD实验组）/OD空白组×100

根据抑制率〉98%的药物浓度为安全给药剂量，再按照3×105个/mL 将细胞接种于六孔板中，每孔加入2 mL 培养基培养48 h，镜下观察细胞90 %融合，分别建立正常组（加入DMEM 培养液100 μL）、LPS组（加入含终浓度为10 μg/mL LPS 的DMEM 培养液100 μL）和药物组（分别为含终浓度为2 mg/mL 纯化物+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培养液 100 μL、含终浓度为 0.02 mg/mL 五味子醇甲+10 μg/mL LPS 的 DMEM培养液100 μL、含终浓度为0.02 mg/mL 五味子醇乙+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培养液 100 μL、含终浓度为0.02 mg/mL 五味子酯甲+10 μg/mLLPS 的 DMEM 培养液100μL、含终浓度为 0.02 mg/mL 五味子甲素+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培养液 100 μL、含终浓度为 0.02 mg/mL五味子乙素+10 μg/mL LPS 的 DMEM 培养液 100 μL），置于CO2培养箱中培养24 h，收集细胞上清液，待测。

1.6.2 IL-10、TNF-α 和 NO 的测定

将待测样品按照ELISA 试剂盒的说明进行加样测定，每个样品设置3个平行孔，加样完毕后利用酶标仪检测IL-10 和TNF-α 的浓度。标准物质浓度用横坐标表示，标准物质平均OD 值用纵坐标表示，绘制标准曲线。待测样品3 次测量的平均OD 值带入标准曲线计算浓度。标准曲线方程分别为：Y=0.002 1x+0.148 6 R2=0.990 2（IL-10，浓度为 pg/mL）和 Y=0.002 2x+0.101 3 R2=0.997 4（TNF-α，浓度为 ng/mL）。

将待测样品按照一氧化氮测试盒的说明配制所需的试剂，再按照操作表分别配制空白管、标准管和测定管（总木脂素纯化物、五味子醇甲对照品、五味子醇乙对照品、五味子酯甲对照品、五味子甲素对照品、五味子乙素对照品）溶液，混匀配制完成的溶液，放在37℃恒温箱中10 min，用UV1800 紫外光度计在光径0.5 cm、波长550 nm 处用测定各管的吸光度值（蒸馏水调零）。

NO 含量/（μmol/L）=（测定OD 值-空白OD 值）/（标准 OD 值-空白 OD 值）×标准品浓度（100 μmol/L）×样品测试前稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 五味子总木脂素类化合物浓度的测定

将供试品溶液按“1.4”色谱条件进行测定，得色谱图见图1，与对照品混合溶液色谱图对照，确定5个色谱峰见表1。5种木脂素对照品的标准曲线见表2。

图1 供试品高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography（HPLC）diagram of trial

表1 高效液相色谱法鉴定北味子中木脂素类成分Table 1 Identification of lignans in Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.by HPLC

表2 5种木脂素对照品回归方程Table 2 Five lignans reference substance regression equation

由表2可知5种成分线性关系在各自浓度范围内均良好。五味子总木脂素类化合物样品溶液中5种木脂素成分含量总和为56%，说明经大孔吸附树脂纯化后，总木脂素纯度较高，为接下来的研究奠定了物质基础。

2.2 抗氧化活性的研究

2.2.1 总抗氧化能力的测定

按照总抗氧化能力试剂盒的操作方法进行测定，结果见表3。

表3 总抗氧化能力测定结果Table 3 Total antioxidant capacity test results

由表3结果可知，北五味子总木脂的总抗氧化能力随着浓度的增加而呈现上升的趋势；与同等浓度的VC对照品相比，北五味子总木脂素类成分的总抗氧化能力是VC的1/7 左右，说明五味子中总木脂素成分总抗氧化能力较好。

2.2.2 对超氧阴离子自由基清除作用的考察

超氧阴离子自由基作为生物体所产生的一种自由基，与多种疾病的发病机制有关，测定中药提取物对超氧阴离子的清除效果，可提示其抗氧化作用及对疾病治疗机理[11-12]。按照1.5.3 方法测定不同浓度北五味子总木脂素的超氧阴离子自由基清除，结果见表4。

表4 超氧阴离子自由基清除率测定结果Table 4 Superoxide anion free radical scavenging rate measurement result

由表4可知，北五味子总木脂素清除超氧阴离子自由基的强度随着浓度的增加而逐渐增强；与同等浓度的VC对照品相比，北五味子总木脂素类成分清除超氧阴离子自由基的强度是VC的1/6 左右，说明其能够较好的清除超氧阴离子自由基。

2.3 抗炎活性的研究

MTT 比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，甲瓒可被二甲基亚砜溶解，用酶标仪在570 nm 波长处测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，该法可用于细胞毒性试验，反映中药提取物对细胞的毒性作用，确定最大给药剂量。按照1.6.1 方法进行细胞毒试验，结果见表5。

表5 MTT 试验结果Table 5 MTT test results

续表5 MTT 试验结果Continue table 5 MTT test results

由表5中数据可知，提取纯化后总木脂素纯化物在含量低于2 mg/mL 时对细胞无毒性。各对照品溶液在含量低于0.02 mg/mL 时对细胞也是无毒性的，但随着他们各自含量的增高，各对照品溶液就会对细胞产生一定的毒性作用，其中五味子对照品甲素和五味子对照品醇甲随着浓度的增加对细胞产生的毒性增加显著。而五味子对照品醇乙、五味子对照品酯甲和五味子对照品乙素浓度升高对细胞产生的毒性增加不大，因此选用0.02 mg/mL 浓度的5种对照品来进行抗炎试验研究。

小鼠单核巨噬细胞Raw264.7可分泌多种炎症相关因子参与机体免疫应答，按照1.6.2 方法利用Elisa法测定北五味子总木脂素类成分及5种五味子木脂素对照品对小鼠单核巨噬细胞分泌相关因子的影响，结果见表6。

表6 总木脂素对小鼠巨噬细胞分泌IL-10、TNF-α 和NO 的影响Table 6 Effects of total lignans on IL-10，TNF-α and NO secretion by mouse macrophages

IL-10 主要由单核巨噬细胞产生，为炎症抑制因子。由表6中数据可知，5种对照品溶液均可促进IL-10 的分泌，其中甲素作用最强、醇乙作用较差，提取纯化后的五味子总木脂素纯化物可使IL-10 含量显著升高。TNF-α 是肿瘤坏死因子的一种，单核细胞和巨噬细胞是产生TNF-α 的主要细胞，为炎症促进因子。5种对照品对LPS 作用后的小鼠巨噬细胞分泌TNF-α均有一定的抑制效果，其中五醇乙作用最强、甲素作用较差，提取纯化后的总木脂素纯化物对TNF-α 的抑制效果较好。硝酸还原酶催化硝酸离子还原成亚硝酸离子的反应称为硝酸还原酶法，它是一种氧化还原酶。5种对照品溶液和五味子总木脂素纯化物都可使由LPS 诱导的细胞产生的NO 浓度降低，其中酯甲作用最强、而醇乙作用较差，提取纯化后的总木脂素纯化物效果较好。

综合上述3种因子的测定结果，说明北五味子总木脂素具有一定的抗炎活性，优于部分木脂素对照品，并且，不同的木脂素类成分在发挥抗炎方面发挥着不同的作用[13-16]。

3 结论

油脂自动氧化是自由基链式反应，该反应过程中可产生多种氧自由基，这些氧自由基具有很高的反应活性，能与人体内脂质、蛋白质、DNA 等大分子物质结合，破坏其结构和功能，导致人体衰老，并引发癌症、动脉粥样硬化和白内障等多种疾病；同时油脂氧化过程中产生的过氧化脂质，不仅可导致食品的营养及感官特性发生劣变，而且可以诱发致突变物质的产生，同时，成为人体衰老的主要因素就是某些自由基的产生和存在。该文采用总抗氧化能力和超氧阴离子自由基清除率两种方法对北五味子中总木脂素的抗氧化活性进行考察，测定的方法简便、快速且稳定性好。试验从整体和部分分别考察，使结果更加客观明了，从试验数据可以看出，北五味子总木脂素达到一定浓度时就可发挥一定的抗氧化活性，本试验对日后研发清除超氧阴离子自由基的天然药抗氧化药物奠定了基础。中药对人体的伤害小，不易产生抗药性，并且来源广泛，本文通过ELISA 试剂盒和一氧化氮试剂盒对北五味子总木脂素进行了抗炎活性的研究。结果显示纯化后的五味子总木脂素和5种对照品对小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-10 和NO 都具有一定的影响，表明总木脂素具有一定的抗炎作用，但是试验只是对总木脂素的抗炎作用进行了一些细胞层面的研究，在医学上并没有给出明确的防治意义，需要在今后的研究中结合动物实验及其他相关试验做更深一步的讨论。北五味子中总木脂素具有良好的抗氧化、抗炎等作用，有研究表明五味子果梗和叶片中有与五味子果实相同的木脂素类成分，可作为五味子果实的良好替代品。若能将五味子各个部分都加以良好应用，运用精密的提取纯化工艺，在以后的生产中可以得到大批量含有药理活性成分的原料，则可在中药研发和保健品生产研发上做出巨大贡献。