气相色谱法同时测定尼尔雌醇原料药中7种有机溶剂的残留量Δ

孙 婷，张 菁，姜建国，刘红莉

（河北省药品检验研究院，石家庄 050011）

尼尔雌醇（Nilethylenol）是一种人工合成的非甾体类雌激素，是雌二醇与雌酮的代谢物。该药的药理作用与雌二醇相似，可在体内代谢为炔雌三醇和雌三醇，以原型、炔雌三醇和雌三醇3种形式由尿液排出。有研究指出，在尼尔雌醇第3位碳原子上引入环戊醚后，可增加其亲脂性，有利于肠道吸收并储存在脂肪组织中而发挥长效作用；第17位碳原子上引入乙炔基后，可保护羟基并增强雌激素活性，但对子宫内膜的增生作用较弱，可适用于围绝经期妇女的雌激素替代治疗[1-3］。尼尔雌醇在合成工艺中使用了甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯等有机溶剂，为确保药品有效、安全以及质量可控，该药按照2015年版《中国药典》（四部）[4］、《药品注册的国际技术要求:质量部分》[5］及其他相关要求[6］，应增加对该药有机溶剂残留量的考察。目前，仅有2015年版《中国药典》（二部）收载了尼尔雌醇原料药和片剂的相关标准[7］，而《英国药典》（2017年版）、《欧洲药典》（9.0版）、《日本药典》（17版）、《美国药典》（41版）均未收载，也尚未见有关测定尼尔雌醇原料药中有机溶剂残留量的报道。为此，本研究采用气相色谱法（GC）同时测定了尼尔雌醇原料药中甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯7种有机溶剂的残留量，旨在为其质量标准的完善提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7890B型GC仪，包括氢火焰离子化检测器、柱温箱（美国Agilent公司）；MCM36型百万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；XS205型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；UL TRASONIC型超声波清洗机（北京中晟铭科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

尼尔雌醇原料药（A公司，批号:20170201A，纯度:99.8%；B公司，批号:20170202B，纯度:99.6%；C公司，批号:20170203C，纯度:99.5%）；甲醇对照品（批号:10945607812，纯度:≥99.9%）、异丙醇对照品（批号:k47208640544，纯度:≥99.9%）、乙腈对照品（批号:JA070530，纯度:≥99.9%）均由美国Merck公司提供；乙醇对照品（批号:20180524，纯度:≥95.0%）、甲苯对照品（批号:20171114，纯度:≥99.5%）、乙酸乙酯对照品（批号:20170824，纯度:≥99.5%）均由国药集团化学试剂有限公司提供；四氢呋喃对照品[阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号:H1602108，纯度:≥99.9%］；甲醇、异丙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法及结果

2.1 色谱条件

色谱柱:DB-WAX毛细管柱（30 m×0.53 mm，1.00 μm）；检测器:氢火焰离子化检测器；分流比:5∶1；载气:氮气（纯度:99.999%）；流速:1.0 mL/min；进样量:1 μL，直接进样；固定相:键合交联聚乙二醇；升温程序:初始温度40℃，保持5 min，以10℃/min速率升温至90℃，再以5℃/min速率升温至200℃；进样口温度：220℃；检测器温度：230℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品贮备液 精密量取甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯对照品适量，分别置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，得单一对照品溶液；分别取上述单一对照品溶液适量至同一量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀释并定容，制成甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯质量浓度分别为60、100、8.2、100、17.8、14.4、100 μg/mL的混合对照品贮备液。

2.2.2 混合对照品溶液 精密量取“2.2.1”项下混合对照品贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液 取原料药样品20 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，即得。

2.2.4 空白对照溶液 以N，N-二甲基甲酰胺为空白对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能实现基线分离，分离度均大于1.5，空白对照溶液对待测物的测定无干扰。

图1 气相色谱图Fig 1 GC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺定容，摇匀，得系列单一线性关系工作溶液。取上述系列线性关系工作溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equation and linear range

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别以信噪比为10∶1、3∶1计算定量限、检测限。结果，甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯的定量限分别为0.24、0.40、0.033、0.40、0.071、0.058、0.40 μg/mL，检测限分别为0.08、0.10、0.01、0.13、0.02、0.02、0.13 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯峰面积的RSD分别为0.5%、0.2%、0.4%、0.6%、0.3%、0.8%、0.7%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.3”项下供试品溶液（批号:20170201A）适量，分别于室温放置0、1、2、4、6、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯峰面积的RSD分别为1.4%、1.5%、1.3%、1.8%、1.1%、1.2%、1.7%（n＝7），表明供试品溶液于室温下放置12 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取原料药样品（批号:20170201A）适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品中有机溶剂的残留量。结果，甲醇、乙醇平均残留量分别为0.01%、0.03%，峰面积的RSD分别为0.7%、0.9%（n＝6），其他成分未检出，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号:20170201A），共9份，每份约20 mg，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并以外标法计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

续表2Continued tab 2

2.10 样品中有机溶剂残留量测定

取3批原料药样品各适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行操作3次，记录峰面积并以外标法计算样品中有机溶剂的残留量，结果见表3。

表3 样品中有机溶剂残留量的测定结果（n＝3，%%）Tab 3 Determination results of residual solvents in samples（n＝3，%%）

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

笔者比较了HP-5（弱极性）、DB-624（中等极性）、HP-210（中等极性）、AT-1000（极性）、DB-Wax（极性）等不同极性毛细管柱的分离效果，结果显示以DB-Wax极性毛细管柱进行分离时的分离效果最好，峰形尖锐且对称，灵敏度较高，故选择DB-Wax极性毛细管柱为本研究的色谱柱。

3.2 溶剂的选择

尼尔雌醇原料药在水中几乎不溶，以水为溶剂时某些残留有机溶剂亦不溶于水，且可能会包裹在未溶解的固态尼尔雌醇样品中，而导致进样浓度不准确，故不宜以水作为溶剂。有研究认为，当样品不溶于水时，可选用高沸点的有机溶剂为溶剂，因其出峰较晚故不会干扰测定[8］。而甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯均为中、低沸点的有机挥发性溶剂。因此，笔者参考上述文献[8］，选择N，N-二甲基甲酰胺为本研究的溶剂及稀释剂。

3.3 有机溶剂残留量测定结果分析

在原料药合成生产过程中，未能完全去除的有机溶剂残留量限度应符合2015年版《中国药典》（四部）[4］中的相关规定:甲醇不得超过0.3%、乙醇不得超过0.5%、乙腈不得超过0.041%、异丙醇不得超过0.5%、甲苯不得超过0.089%、四氢呋喃不得超过0.072%、乙酸乙酯不得超过0.5%。其中，甲醇、乙腈、甲苯、四氢呋喃为二类药品生产质量管理规范质量要求限制使用溶剂；乙醇、异丙醇、乙酸乙酯为三类限制使用溶剂。本研究中，甲醇、乙醇的测定结果均低于文献[9］结果及2015年版《中国药典》（四部）[4］中的相关规定，乙腈、异丙醇、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯在3批样品中均未检出，有机溶剂的残留量符合2015年版《中国药典》（四部）的要求。

此外，笔者参考相关文献[10-15］，建立了采用GC法同时测定尼尔雌醇原料药中7种有机溶剂的残留量。经方法学验证，该方法具有良好的系统适用性，可为尼尔雌醇质量标准的完善提供参考。

综上所述，该方法灵敏度较高、准确度较好，可用于同时测定尼尔雌醇原料药中甲醇、乙醇、乙腈、异丙烷、甲苯、四氢呋喃和乙酸乙酯的残留量。