基于近红外光响应性的盐酸阿霉素纳米脂质体的制备工艺优化Δ

祝侠丽，王莎莎，李玲华，巴妍妍，刘黎明，贾永艳

（河南中医药大学药学院，郑州 450046）

恶性肿瘤已成为威胁人类健康的一大杀手，也是现代医药学研究领域面临的巨大挑战。盐酸阿霉素（Doxorubicin hydrochloride，DOX）作为一种广谱抗肿瘤药物，因其普通剂型具有明显的系统毒性而被临床限制使用[1］。纳米脂质体可通过高通透性和滞留效应（Enhanced permeability and retention effect，EPR）将化疗药物靶向输送到肿瘤组织，可提高药物的疗效，并降低毒性，同时具有明显的缓释作用和较高的生物相容性[2］。尽管聚乙二醇（PEG）化的DOX脂质体已应用于临床，但仍存在药物被动释放速度过慢等问题[3］。近年来，基于纳米材料的肿瘤光热治疗（Photothermal therapy，PTT）技术作为一种新型的治疗方法，因其特异性强、创伤小、并发症少等优势，逐渐受到学者的关注[2］。纳米硫化铜因具有成本低、光热稳定性好、细胞毒性低以及粒径、形貌可控等特点[4］，在PTT领域具有较大的应用前景。为此，本研究将纳米硫化铜和DOX共同包裹制备了具有近红外光响应性的DOX纳米脂质体，并通过星点设计-响应面法优化DOX纳米脂质体的制备工艺，旨在为PTT的研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BSA224S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-100型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；N-1100-OSB-2100型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；92-llN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；T6-1650E型新世纪紫外-可见分光光度（UV）计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Nano-ZS90型电位及粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；MW-GX-808/3000 mW型激光器（中国科学院长春激光所）。

1.2 药品与试剂

DOX原料药（大连美伦生物技术有限公司，批号:25316-40-9，纯度:≥99%）；豆磷脂（天津市光复精细化工研究所，批号:20160403）；胆固醇（郑州奇华顿化工产品有限公司，批号:20150527）；纳米硫化铜（河南中医药大学药学院自制，批号:20180317）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4，批号:20171204）、聚维酮（批号:20161009）均由北京博奥拓达科技有限公司提供；三氯甲烷、甲醇等均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 DOX纳米脂质体的制备

采用薄膜分散法[5-6］。精密称取豆磷脂、胆固醇各适量，置于同一茄形瓶中，加三氯甲烷适量溶解，摇匀，后将茄形瓶于40℃下旋转减压蒸发以除去有机溶剂，至形成均匀的薄膜，后加入含有DOX和聚维酮、纳米硫化铜的PBS溶液，超声（功率:500 W，频率:40 kHz）处理20 min，后再超声（功率:250 W，频率:25 kHz）处理，每次3 s，间歇3 s，共循环20次，即得含有纳米硫化铜的DOX纳米脂质体。另取薄膜，加入含有聚维酮、纳米硫化铜的PBS溶液，按上述操作“超声处理20 min起至超声处理”，即得空白脂质体。

2.2 DOX纳米脂质体的含量测定

2.2.1 检测波长的确定 采用UV法测定含量[7］。精密称取DOX原料药5.05 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度为1.01 mg/mL的DOX贮备液；取上述DOX贮备液适量，加甲醇稀释，制成质量浓度为8.08µg/mL的DOX供试品溶液。另取“2.1”项下空白脂质体适量，加甲醇破乳，加甲醇稀释100倍，即得空白脂质体供试品溶液。以甲醇为空白对照，取上述DOX供试品溶液、空白脂质体供试品溶液于200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，详见图1。由图1可知，DOX供试品溶液的最大吸收波长为232 nm，而空白脂质体供试品溶液在232 nm波长处无吸收，表明空白辅料对测定无干扰，故选择检测波长为232 nm。

2.2.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下DOX贮备液，加PBS溶液稀释，制成质量浓度分别为1.01、4.04、8.08、12.12、16.16 µg/mL的系列线性关系工作溶液，取上述系列线性关系工作溶液适量，分别于232 nm波长处测定吸光度。以质量浓度（x，µg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得DOX的回归方程为y＝0.056 7x+0.014 9（r＝0.999 7），结果表明，DOX检测质量浓度线性范围为1.01～16.16µg/mL。经方法学验证，精密度、稳定性、重复性均符合2015年版《中国药典》（四部）要求[8］。

图1 紫外吸收光谱图Fig 1 UV absorption spectrum

2.3 包封率、载药量、粒径的测定

采用超滤离心法测定包封率和载药量[9-10］。精密量取“2.1”项下DOX纳米脂质体0.2 mL，加甲醇破乳并定容至5 mL，于232 nm波长处测定吸光度，记为A总。精密量取“2.1”项下DOX纳米脂质体1 mL，置于超滤管（30 kDa）中，以5 000 r/min离心20 min，滤过，取续滤液0.2 mL，加水定容至5 mL，于232 nm波长处测定吸光度，记为A游。将A总、A游按“2.2.2”项下回归方程计算DOX质量浓度，并按如下公式计算包封率和载药量。包封率（%）＝（W总－W游）/W总×100%，载药量（%）＝（W总－W游）/M总×100%（式中，W总表示总的药物质量，W游表示游离药物的质量，M总表示DOX纳米脂质体的总质量）。另取“2.1”项下DOX纳米脂质体适量，加超纯水稀释10倍，采用粒度分析仪测定粒径。

2.4 DOX纳米脂质体处方工艺优化

2.4.1 星点试验设计与结果 参考预试验结果及相关文献[11-13］，选择以豆磷脂与药物质量比（X1，mg/mg）、豆磷脂与胆固醇质量比（X2，mg/mg）、超声时间（X3，min）为因素，以粒径（Y1，nm）、包封率（Y2，%）、载药量（Y3，%）为指标，采用3因素3水平试验方案。因素与水平见表1，试验方案与结果见表2。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

2.4.2 模型拟合 采用SPSS 17.0软件对表2数据进行分析，得P＝0.411（P＞0.05），提示包封率在各组之间的差别相对较小（P＞0.05）。因此，以粒径和载药量为指标，采用Design-expert 8.0.6软件进行多元二次多项回归拟合，得粒径和载药量对X1、X2、X3的数学回归模型。以粒径为指标时，Y1＝215.30－123.90X1+13.82X2+13.13X3－33.07X1X2－25.38X1X3+1.23X2X3+77.49X12+5.09X22+2.94X32（r＝0.985 4）；以载药量为指标时，Y3＝5.56－4.40X1+0.21X2－0.046X3+0.075X1X3－0.017X2X3+2.38X12－0.056X22－0.021X32（r＝0.999 9）。r均大于0.9，提示模型设计的拟合效果及预测性均较好。对该模型进行方差分析，结果见表3。

表2 试验方案与结果Tab 2 Experiment plan and results

2.4.3 各因素交互作用分析 采用Design-expert 8.0.6软件以豆磷脂与药物质量比（X1，mg/mg）、豆磷脂与胆固醇质量比（X2，mg/mg）、超声时间（X3，min）为因素，以粒径（Y1，nm）和载药量（Y3，%）为指标，绘制响应面图，详见图2。

由图2A可知，因素X1与X2交互作用显著，随着X1增大，粒径也随之增大；由图2B可知，因素X2与X3交互作用显著，随着X2的增大，粒径呈现先减小后增大的趋势；由图2C可知，因素X1与X2交互作用显著，随着X2的增大，载药量逐渐减小；由图2D可知，因素X1与X3交互作用显著，随着X1的增大，载药量也逐渐减小。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

图2 各因素对粒径和载药量影响的响应面图Fig 2 Response surface plots of each factor to particle size and drug-loading amount

2.4.4 最优制备工艺的确定 基于Design-expert 8.0.6软件对所建模型进行参数最优分析，得最优制备工艺为豆磷脂与药物质量比13.30∶1（mg/mg）、豆磷脂与胆固醇质量比4.09∶1（mg/mg）、超声时间10 min，得到预测粒径为196.3 nm，载药量为10.68%。

2.4.5 验证试验 按上述最优制备工艺进行验证，平行制备3批DOX纳米脂质体，详见表4、图3。由表4、图3可知，实测值与预测值一致性良好，提示优化所得制备工艺简单、可行，其粒径符合正态分布。

表4 最优制备工艺验证结果Tab 4 Results of optimal preparation technology validation

2.5 DOX纳米脂质体的光热转换试验

参考相关文献进行DOX纳米脂质体的光热转换试验[14］。取“2.1”项下DOX纳米脂质体，加水稀释，制成纳米硫化铜质量浓度为0.1、0.2、0.5 mg/mL的纳米混悬液。分别取上述纳米混悬液3 mL，置于石英比色池中，采用激光器（2.5 w/cm2）照射（激发波长:808 nm），每30 s记录1次温度随时间的变化值，以水为对照组，以时间为横坐标、温度为纵坐标，采用OriginPro 8.5.1软件绘制光热转换曲线，详见图4。

图3 粒径分布图Fig 3 Distribution of particle size

图4 光热转换曲线图Fig 4 Light heat transformation curve plot

由图4可知，含有纳米硫化铜不同质量浓度的DOX纳米脂质体在808 nm激光照射下，温度可随照射时间的延长明显上升，浓度越高温度上升越快。当照射时间为8 min时，纳米硫化铜质量浓度为0.1、0.2、0.5 mg/mL时的温度分别为47.6、51.1、54.9℃，此时超纯水温度基本不变，维持在24.6℃。提示，DOX纳米脂质体具有浓度和时间依赖性的光热转换效应，可结合近红外激光照射进行PTT治疗。

3 讨论

本课题以亲水性纳米硫化铜为光热转换剂，采用薄膜分散法制备了DOX纳米脂质体，试验中通过旋转减压蒸发，可有效避免纳米脂质体中有机溶剂的残留；此外磷脂易吸潮，在保存过程中应注意避潮，可将其放入真空袋中以保持干燥性。DOX是一种需要避光保存的药物[15］，研究过程中需注意避光操作，且制得的DOX纳米脂质体也应避光保存。

本研究采用星点设计-响应面法优化了DOX纳米脂质体的制备工艺，优化后的最佳工艺为豆磷脂与药物质量比13.30∶1（mg/mg）、豆磷脂与胆固醇质量比4.09∶1（mg/mg）、超声时间10 min。按此优化工艺所得DOX纳米脂质体的粒径为（200.5±25.1）nm、载药量为（11.02±0.20）%，该工艺简单、可行。光热转换试验结果显示，DOX纳米脂质体具有浓度和时间依赖性的光热转换效应，这可为近红外光响应性肿瘤靶向递药载体的进一步研究提供参考。

综上所述，本研究所建含量测定方法简便、准确度较好，优化所得制备工艺简单、可行。