猪圆环病毒2型抗体间接ELISA检测方法的建立

徐保娟，王丽萍，崔晓霞，宫 晓，孙厚民，郭伟伟，李陆梅，范根成，荣 俊

（1.青岛易邦生物工程有限公司，青岛 266114；2. 动物基因工程疫苗国家重点实验室，青岛 266114；3. 长江大学，荆州 434000）

猪圆环病毒2型是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等相关疾病的主要病原，对猪养殖业具有巨大危害，严重阻碍了我国养猪业的发展，PCV2感染现已成为危害我国规模化猪场养猪生产的重要免疫抑制性疫病之一[1]。通常情况下，PCV2感染没有明显的季节性，在一年四季均可发生，PCV2感染率很高，但主要是隐性感染，猪群感染后不易被察觉，但易引发其他病原体的继发侵染[2]。PCV2的衣壳蛋白（Cap蛋白）主要分布在宿主细胞核中，它有3个特异性抗原位点，这为建立特异性检测PCV2的血清学方法奠定了基础，其编码产物也成为了检测 PCV2感染的主要抗原[3-4]。本研究建立的猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2感染或疫苗免疫猪血清中和抗体的快速检测。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血清 猪圆环病毒2型标准阳性血清及阴性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌、猪弓形虫、猪衣原体阳性血清，40份采自猪免疫PCV2疫苗后35 d的血清（20份免疫的是青岛易邦生物工程有限公司的PCV2基因工程亚单位疫苗、20份免疫的是江苏勃林格殷格翰生物制品有限公司的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗），以上血清均由青岛易邦生物工程有限公司技术中心实验室制备；猪口蹄疫阳性血清购自中国农业科学院兰州兽医研究所；PCV2强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清由中国动物卫生与流行病学中心提供；HRP-羊抗猪IgG购于美国BET HYL公司。

1.1.2 ELISA试验相关试剂 PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）、包被液（0.05 mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液）、洗液（0.01 mol/L pH 7.2磷酸钾缓冲液）、封闭液（2%BSA 0.01 mol/L pH 7.2 PBS）、洗涤液（0.45 mol/L pH 7.2磷酸钾缓冲液）、底物溶液A（pH 5.0柠檬酸醋酸缓冲液）、底物溶液B（0.01 mol/L pH 5.0 TMB-四甲基联苯胺）和终止液（2 mol/L硫酸）由青岛易邦生物工程有限公司技术中心提供。

1.2 方法

1.2.1 ELISA试验步骤 样品稀释：将按要求稀释的血清样品依次加入包被板中，37℃放置30 min；洗涤：加入洗涤液100 μL，弃洗涤液，每孔加300 μL蒸馏水，洗涤5次后，在吸水纸上拍干；温育：向包被板中加入酶标结合物100 μL，37℃放置30 min；洗涤方法同前；显色：加入底物溶液A和底物溶液B各100 μL，轻轻摇匀，37℃避光反应10 min；终止：每孔加100 μL终止液终止反应。

1.2.2 抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定 按方阵滴定法进行，用包被液将PCV2 Cap蛋白抗原稀释成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，每孔100 μL，4℃过夜；阳性血清和阴性血清分别作1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀释，每孔100 μL，每孔重复3次。进行ELISA试验，测定各孔OD450，计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清孔之间的OD450的比值（P/N值），选择P/N值最大孔的稀释倍数作为抗原和血清的最佳稀释浓度。

1.2.3 包被条件的确定 将包被板分别置于37℃ 2 h、4℃过夜和37℃2 h+4℃过夜3种条件下包被，对PCV2阴性、阳性血清进行ELISA试验，每个样品重复3次，测定各孔OD450，计算P/N值，选择最佳包被条件。

1.2.4 封闭液的确定 分别用250 μL 2%BSA、 2%明胶、5%脱脂奶粉和1%卵清蛋白进行封闭，计算P/N值，选择最佳封闭条件。

1.2.5 血清最佳结合时间的确定 ELISA试验中，血清结合时间分别设定为15、30、45 min，每组设3个重复孔，测定各孔OD450，计算P/N值，选择最佳血清结合时间。

1.2.6 二抗最佳稀释度及结合时间的确定 ELISA试验中，HRP-羊抗猪IgG稀释度分别为1∶6000、1∶8000、1∶10 000、1∶12 000，每组设4个重复孔，于37℃分别温育15、30、45 min测定各孔OD450，计算P/N值，选择二抗最佳稀释度及结合时间。

1.2.7 底物作用时间的确定 加入TMB，分别于37℃避光反应5、10、15 min；按100 μL/孔加入终止液，测定OD450，计算P/N值，选择底物最佳作用时间。

1.2.8 间接ELISA方法阴、阳性血清临界值的确定 在选定的ELISA最佳反应条件的基础上，分别取3份标准阳性血清及3份阴性血清进行测定OD450。同时，检测158份PCV2阴性猪血清的OD450，并设定阴、阳性血清对照。根据阴性标准血清和阳性标准血清的OD450，将158份阴性血清的平均值加5个标准差定位阴性血清的OD450临界值，阴性血清的平均值加6个标准差定位阳性血清的OD450临界值。计算相应的S/P临界值。S/P=（样品OD450-标准阴性OD450）/（标准阳性OD450-标准阴性OD450）

1.2.9 间接ELISA方法的敏感性试验 将PCV2阳性血清作1∶3200、1∶6400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 5个稀释度，分别用本研究建立的PCV2 ELISA抗体检测方法及韩国JBT PCV2 ELISA抗体检测方法进行检测，记录试验结果。

1.2.10 间接ELISA方法的特异性试验 分别将猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪胸膜肺炎杆菌、副猪嗜血杆菌、猪弓形虫、猪衣原体、猪圆环病毒特异性阳性血清及猪圆环病毒特异性阴性血清作1∶800倍稀释后，用本研究建立的ELISA方法进行检测，并设PCV2阴性、阳性血清对照，100 μL/孔加入酶标板，每份血清重复2孔，进行OD450测定，试验重复3次。

1.2.11 间接ELISA方法的重复性试验 用同一批纯化的Cap蛋白制备的包被板和4批不同时间纯化的Cap蛋白制备的包被板，分别取10份PCV2强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清进行检测，在其他条件不变的情况下，按照本研究建立的ELISA方法进行测定，每个样品设4个重复，根据OD450进行统计学分析，分别判定批内重复性和不同批次间的可重复性。

2 结果

2.1 最佳Cap蛋白包被浓度与血清稀释度的确定 由表1结果可知，随着Cap蛋白包被浓度的减少以及血清稀释倍数的增大，血清的OD450不断降低，当Cap蛋白包被浓度在12.5～25 μg/mL，血清稀释倍数为1∶800时，P/N值最大，但考虑到要保证足够的包被蛋白，因此我们选择25 μg/mL作为Cap蛋白最佳包被浓度，而血清最佳稀释度为1∶800。

2.2 包被条件的确定 由表2可知，在4℃过夜的包被条件下，P/N值最大，P/N值为10.57。因此，选取4℃过夜作为最佳包被条件。

2.3 封闭液的确定 由表3可知，采用2%的BSA封闭的阴性值低，阳性值高，P/N平均值最大，据此，选用2%的BSA作为最佳封闭液。

表1 最适包被浓度与血清稀释度的确定Table 1 Determination of optimal concentration and serum dilution

表2 最佳包被条件的确定Table 2 Determination of optimum package conditions

表3 最佳封闭液的确定Table 3 Determination of the best closed liquid

2.4 血清最适结合时间的确定 由表4可知，加入血清之后，在37 ℃作用30 min时P/N值最大，因此确定最佳反应时间为30 min。

2.5 二抗最佳稀释度及结合时间的确定 由表5可知，酶标记结合物作用时间30 min，稀释度在1∶8000和1∶10 000时，P/N值均较高，考虑到酶标记结合物的保存期，最终确定二抗最佳稀释度为1∶8000，最佳结合时间为30 min。

2.6 底物作用时间的确定 由表6可知，底物作用时间10 min时，P/N平均值最大。因此，我们选择10 min作为最佳显色时间。

2.7 间接ELISA方法阴、阳性血清临界值的确定

2.7.1 阴性、阳性标准血清检测结果 分别将3份PCV2阴性标准血清和3份PCV2阳性标准血清作1∶800倍稀释后进行检测，结果见表7。试验结果表明，PCV2阴性血清的OD450值为0.061～0.089，均＜0.10，PCV2阳性血清的OD值为0.630～0.734，均≥0.60，阳性对照血清平行孔相差值分别为0.041、0.085和0.057，均≤0.30。因此，我们将研制的试剂盒中的阴、阳性对照血清的标准定为阳性对照血清OD450≥0.60，阴性对照血清OD450＜0.10。

2.7.2 158份阴性血清检测结果 将158份阴性血清检测结果用SPSS进行统计分析。本次试验阴性血清平均OD450为0.085（表8），阳性对照OD450为0.651，阳性对照血清平行孔值相差≤0.3。检测结果成立。

2.7.3 临界值（OD450）的确定 按统计学正态分布的规律，99.993666%的面积在平均数加减4个标准差。为了降低假阳性，我们将阴性临界值定为平均值加5个标准差，阳性的临界值定为平均值加6个标准差。根据158份PCV2阴性血清的检测结果（表9），阴、阳性血清判定标准：当OD450≤0.200（阴性平均值+5×标准差）时判为阴性；当OD450≥0.223（阴性平均值+6×标准差）时判为阳性；当0.200＜OD450＜0.223时判为可疑。

表4 血清最适结合时间的确定Table 4 Determination of the optimal binding time of serum

表6 底物作用时间的确定Table 6 Determination of substrate action time

根据阴性标准血清OD450（0.085）和阳性标准血清的OD450（0.651），结合临界值（OD450）的判定标准，计算S/P临界值。在选定的ELISA最佳反应条件的基础上，检测了3份PCV2标准阴性血清和3份PCV2标准阳性血清的OD450。通过S/P值的计算确定了临界值判定标准：阳性对照血清OD450平均值应≥0.60，且2份阳性对照血清OD450相差应≤0.30；阴性对照血清OD450平均值应＜0.10，实验成立，否则无效。当S/P≥0.25为阳性，0.20＜S/P＜0.25为可疑，S/P≤0.20为阴性。

表5 二抗最佳稀释度及结合时间的确定Table 5 Determination of the best dilution and binding time of the second antibody

2.9 间接ELISA方法的敏感性试验 由表10可见，本研究建立的ELISA检测方法（自制试剂盒）检测3份PCV2阳性血清的阳性滴度为1∶12 800～1∶25 600，高于韩国试剂盒的阳性检出滴度1∶3200～1∶6400。说明本研究建立的ELISA检测方法具有较高的灵敏性。

2.10 间接ELISA方法的特异性交叉试验 由表11可见，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌、猪弓形虫、猪衣原体等10种其他病原体的20份阳性血清及2份PCV2阴性血清检测结果均为阴性，2份PCV2阳性血清为阳性，表明本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性。

2.11 间接ELISA方法的重复性试验

2.11.1 批内重复 根据表12可以看出，批内间重复性良好，C.V%值为2.26%～7.60%，均小于10%。

2.11.2 批间重复 根据表13可以看出，批间重复试验的变异系数均值（C.V%）为1.67%～6.41%，小于10%。表明不同批次纯化的Cap抗原具有良好的稳定性，证明本研究建立的ELISA方法批间重复性良好。

3 讨论

表7 阴性、阳性标准血清检测结果Table 7 Positive and negative serum test results

表8 158份PCV2阴性血清ELISA检测OD450统计结果Table 8 158 PCV2 negative serum OD450 of ELISA detection results

表9 158份PCV2阴性血清ELISA检测结果Table 9 The ELISA results of 158 PCV2 negative serum

表10 敏感性试验比较结果Table 10 The results of the sensitivity tests

表11 特异性试验结果Table 11 Results of specific tests

（续上表）

表12 批内重复性试验结果Table 12 Results of repeated trials in batches

表13 批间重复性试验结果Table 13 Results of repeated trials between batches

（续上表）

目前，对猪圆环病毒2型抗体的检测方法主要包括ELISA检测法、免疫荧光检测法、间接血凝试验和放射免疫测定，其中ELISA检测法和间接血凝试验在生产实践中应用较为广泛。间接血凝作为抗体检测的经典方法在国内外得到了广泛的应用，但是该方法存在敏感性低、待检血清需经过灭活处理、增加了检测的时间和检测的难度、且肉眼判读、误差大等缺点，不适合规模化养殖场的大面积检测。间接血凝作为抗体检测的经典方法在国内外得到了广泛的应用，但是该方法存在敏感性低、待检血清需经过灭活处理、增加了检测的时间和检测的难度、且肉眼判读、误差大等缺点，不适合规模化养殖场的大面积检测。间接ELISA具有微量、敏感性高、特异性强、操作简便、操作人员不需培训、样品不需预处理、无需特殊仪器设备、特别适合于基层兽医部门和规模化养殖场的快速诊断[5-6]在猪圆环病毒的抗体水平检测上具有巨大的发展潜力。

间接ELISA的优点使得其在生产中得到广泛应用，马超英[7]通过对4种抗体检测方法的比较，确定间接ELISA的特异性和敏感性均较高；黄立等[8]通过间接ELISA成功检测出豫南地区的PCV2抗体水平；张琪等[9]成功建立山羊痘病毒抗体的间接ELISA抗体检测方法；曹增国等[10]成功建立埃博拉病毒抗体的间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗体检测方法由于具有敏感性高、特异性强、操作简便等优点，正在被广泛应用。

本研究通过条件不断优化，确定当抗原包被浓度为25 μg/mL、封闭液为2%的BSA-PBS、血清1∶800稀释且孵育时间为30 min、二抗为1∶8000稀释且孵育时间为30 min、底物作用时间10 min时，P/N值最大。确定阴、阳性血清临界值：当S/P≥0.25为阳性血清；0.20＜S/P＜0.25为可疑血清；S/P≤0.20为阴性血清。同时，对其敏感性、特异性以及重复性进行了试验，结果表明，我们成功建立了敏感性高、特异性强及重复性好的猪圆环病毒2型抗体间接ELISA检测方法，为PCV2感染地区的血清流行病学调查及疫苗免疫评价提供了一种有效可靠的技术手段，为PCV2血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。