MMP-7在婴幼儿血管瘤中的表达及意义

李堂江，向 敏，吕 欣，王 凯，张 超

(1.遵义医科大学附属医院 小儿矫形外科，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属医院 心电图科，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学附属医院 病理科，贵州 遵义 563099；4.遵义医科大学第二附属医院 外科，贵州 遵义 563000)

血管瘤是婴幼儿常见的良性肿瘤，好发于四肢躯干部位，其有自行消退趋势。特殊部位血管瘤，如四肢关节部位、鼻尖、眼睑、嘴唇、会阴部等在其发生、发展、消退过程中易破溃、感染，造成局部瘢痕形成，甚至出现毁容，因此需积极治疗。目前血管瘤发病机制还不完全清楚，其治疗方法也多种多样，效果参差不齐。近年来研究发现基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)在所有肿瘤组织中均有高活性及高表达率。而基质金属蛋白酶7(MMP-7)是金属蛋白酶家族(MMPs)中最重要的酶之一，在体内参与炎症发生、细胞增殖、血管发生发展、肿瘤转移等生物学行为。Ki67是一种细胞增殖相关核抗原，其功能与细胞有丝分裂密切相关，在细胞增殖中不可缺少，但其确切机制尚不清楚。其数值越高，说明细胞增生越活跃，可直接、敏感地反映肿瘤细胞的增殖活性，并且较全面反映增殖细胞数量[1]。因此本研究拟通过免疫组化MaxVision法及夹心法酶联免疫吸附实验(ELIDA)检测MMP-7在婴幼儿血管瘤组织中及血清中的表达情况，检测Ki67并分析其意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集遵义医科大学附属医院2010年1月至2016年6月未经其他治疗、单纯行手术切除并经病理诊断为血管瘤的标本，结合Mulliken分类法和增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况重新分类，提取增生期血管瘤20例、消退期血管瘤20例。其中男23例，女17例，患儿年龄为2～36月，平均13.5月。另外取正常婴幼儿皮肤组织20例作对照，全部标本福尔马林浸泡，石蜡包埋后切片，行免疫组织化学检查。ELISA方法 用EDTA抗凝管采集明确诊断，未经任何治疗的增生期血管瘤36例外周血，正常36例婴幼儿外周血标本，置4 ℃冰箱暂存，2 h内送实验室，经低温离心(1 500 rpm， 4 ℃，10 min)分离，取上层血浆分装后保存-80 ℃冰箱待检(血管瘤患者标本及正常对照组婴幼儿的外周血清标本均收集于本院检验科正常体检及住院治疗血管瘤患者检验使用后所留血清标本，并离心后放-80 ℃冰箱待检)。

1.1.2 主要试剂 即用型快捷免疫组化MaxVision/HRP检测试剂盒、UItra DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司；鼠抗人单克隆MMP-7抗体、鼠抗人单克隆Ki67抗体购于英国abcom公司；基质金属蛋白酶-7(总)ELISA试剂盒购于武汉博士德生物有限公司。

1.2 实验方法 所有操作严格按照MaxVision/HRP检测试剂盒说明书进行。实验步骤简述如下：石蜡组织块经4 μm切片，依次脱蜡、水化，切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS,分别滴加一抗(鼠抗人单克隆MMP-7抗体，体积稀释比例为1∶200浓度，鼠抗人单克隆Ki67抗体，体积稀释比例为1∶200)，室温孵育60 min，PBS冲洗3×3 min，除去PBS，切片上滴加MaxVision/HRP试剂，室温下孵育15 min，PBS冲洗3×3 min；除去PBS，切片上滴加新鲜配制DAB显色试剂显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。阳性对照以采取胃癌切片(由试剂公司提供)，以PBS代替一抗作为阴性对照。应用ELISA双抗体夹心法检测外周血中MMP-7蛋白水平，严格按照MMP-7 ELISA KIT说明书进行操作。

1.3 结果判定 免疫组化：结果以半定量积分法进行阳性结果判断[2]。着色强度评分，0分：无着色；1分：浅黄色着色；2分：棕黄色着色；3分：棕褐色着色。 200倍镜下每张切片10个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分比：<10%为1分，10%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。半定量免疫反应积分为染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0～2分为无表达，3～4分为弱表达，6～8分为中表达，9～12为强表达。酶联免疫吸附法：检测结果在酶标仪上于450 nm处测定各孔的OD值。标准曲线的建立：分别以浓度为0、156、313、625、1 250、2 500、5 000 pg/mL的MMP-7标准蛋白为S0-S7标准点，检测其OD值，以S0点为空白对照，以S0-S7标准品的浓度为纵坐标，相应的OD值为横坐标，制作出标准品线性回归标准曲线，求得标准曲线公式及相关系数，根据公式计算MMP-7浓度值(pg/mL)。

2 结果

2.1 正常皮肤及血管瘤组织的MMP-7表达 MMP-7在增生期血管瘤中高表达(见图1A)，消退期血管瘤中低表达或不表达(见图1B)，正常皮肤组织不表达(见图1C)。MMP-7在增生期血管瘤中表达与消退期血管瘤中的表达差异有统计学意义(P<0.05，见表1)；MMP-7在增生期血管瘤中的表达水平与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

A：增生期MMP-7表达(×200)； B：消退期MMP-7表达(×200)；C：正常皮肤组织MMP-7表达(×200) 。图1 MMP-7在正常组织、消退期及增生期血管瘤组织的染色结果

表1MMP-7在正常组织、消退期及增生期血管瘤组织中的表达(n=20)

组别无表达弱表达中等表达强表达χ2P阳性表达率正常组织2000032.7270.000∗0消退期28642.1050.147∗∗90%增生期02216400.0000∗∗∗100%

比较时弱表达、 中等表达、 强表达合并为表达;*：正常组织与消退期组比较;**：消退期组与增生期组比较;***：正常组织与增生期组比较。

2.2 正常皮肤及血管瘤组织中Ki67表达 Ki67在增生期血管瘤中高表达(见图2A)，在消退期血管瘤低表达(见图2B)，在正常皮肤组织中不表达或弱表达(见图2C)。Ki67在增生期血管瘤与消退期血管瘤、增生期与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

A：增生期血管瘤Ki67表达；B：消退期血管瘤Ki67表达；C：正常皮肤组织Ki67表达；(×200)。图2 Ki67在正常组织、消退期及增生期血管瘤组织的染色结果

表2Ki67在正常组织、消退期及增生期血管瘤组织中的表达(n=20)

组别无表达弱表达中等表达强表达χ2P阳性表达率正常组织191009.5340.002∗5%消退期1172010.9960.000∗∗45%增生期2141332.7270.0000∗∗∗90%

比较时弱表达、 中等表达、 强表达合并为表达;*：正常组织与消退期组比较;**：消退期组与增生期组比较;***：正常组织与增生期组比较。

2.3 血管瘤患者与正常对照血清MMP-7水平 血管瘤患儿血清中MMP-7(718.64±146.03 pg/mL)明显高于正常对照组血清中MMP-7(238.21±48.27)，两组之间差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

组别MMP-7 ( pg/mL)P增生期718.64±146.030.000168∗正常238.21±48.27

与对照组比较，P<0.05。

3 讨论

目前发现MMPs家族在所有肿瘤组织中均有高活性及高表达[3-6]。基质金属蛋白酶7(MMP-7)是金属蛋白酶家族(MMPs)中最重要的酶之一，基因位于11q21-22，由于缺乏血红蛋白域，MMP-7就成为MMPs家族中最小的蛋白酶[7]。MMP-7在体内参与多种组织病理和生理过程，其作用十分广泛，可降解蛋白多糖、纤维连接素、弹力纤维及Ⅳ型胶原纤维等，是基质降解的执行酶，在体内参与细胞增殖分化、炎症反应、新生血管形成、肿瘤转移等生物学行为[8-10]。MMP-7与其他MMPs之间的区别在于，它由肿瘤细胞分泌的，而其他MMPs都是肿瘤基质细胞所分泌的，这提示MMP-7的表达可能与肿瘤发生发展密切相关[11-12]。而婴幼儿血管瘤的发病机制目前仍然不清楚，其发生的原始动因不明确，但其发生发展过程中最本质的特征都是血管内皮细胞异常增殖，而细胞外基质的降解是血管生成的关键步骤，是肿瘤发生发展的前提。MMP-7能降解细胞膜上的Fas配体，抑制Fas介导的细胞凋亡，促进肿瘤的生长[13]。MMP-7促进肿瘤血管的生成，已经被证明在体外实验研究中以剂量依赖的方式，加速在人脐静脉内皮细胞的增殖[14]。MMP-7和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肿瘤的血管内皮细胞中协同表达，VEGF改变了内皮细胞的活化形式，增强了MMP-7的释放，加快了基底膜的降解和内皮细胞迁移[15]。

本研究通过对增生期、消退期血管瘤及正常皮肤组织免疫组织化学方法分析表明，在婴幼儿血管瘤中有MMP-7及Ki67表达，在增生期高表达，在消退期低表达，在正常皮肤组织中不表达或弱阳表达。推测其促进血管瘤发生可能通过上述机制协同而促进血管内皮细胞增殖，促进新生血管形成，进而促进血管瘤的生长。有学者研究发现，MMP-2和MMP-9在增生期患者血液中浓度升高[16]，MMP-9在内皮细胞迁移和血管形成中发挥重要作用[17]。目前相关文献表明，MMP-2和MMP-9是通过β肾上腺素受体进行调控[18-21]。而MMP-2、MMP-9的活化是通过MMP-7激活其相应前体而被活化的[22]。有关文献表明，抑制MMP-7能够阻碍人微血管内皮细胞的血管形成[23]。

本研究通过对血管瘤患儿与正常对照组血清酶联免疫分析结果也表明，在增生期血管瘤患儿血清中，其MMP-7的表达水平较对照组明显升高，提示在增生期血管瘤内皮细胞中存在MMP-7大量分泌，其能加速细胞基底膜及细胞外基质的降解，在降解过程中还能诱导细胞释放大量血管内皮生长因子，促进肿瘤新生血管和脉管形成，为肿瘤细胞的增殖提供必要的营养基础与转移途径[24]。同时MMP-7活化MMP-2和MMP-9活性，促进血管内皮细胞迁移，促进瘤体增殖分化；而在消退期MMP-7的表达水平下降，MMP-2和MMP-9活化降低，使其合成减少，使得各种血管内皮细胞生长因子减少，不能降解细胞基底膜及细胞外基质，使血管瘤内皮细胞不能迁移，从而阻止新的血管形成[25]。而目前我们在对血管瘤患儿在口服普萘洛尔前后MMP-7水平变化的研究中也发现，其服药前后血清中的MMP-7水平也有显著差异性，推测其可能是通过β肾上腺素受体抑制剂抑制MMP-7表达，从而抑制MMP-2、MMP-9表达，使内皮细胞生成减少，促进瘤体消退，但具体机制还不明确，还需进一步研究。

本研究证实了婴幼儿血管瘤患者在组织及血清中均有MMP-7表达，在增生期高表达，消退期低表达，正常组织中不表达或弱表达，而Ki67在增生期高表达，消退期低表达，提示MMP-7表达水平可能和血管瘤的增生、分化、消退相关，因此临床上我们认为可以通过抑制MMP-7表达，抑制血管内皮细胞增殖，促进血管瘤的消退，但因本实验样本量少，其具体作用机制还需进一步研究。