山西境内一种野生双孢蘑菇菌株特异性鉴定*

张红刚，郭明慧**，郭 尚，梁枝荣

（1.山西省农业科学院食用菌研究所，山西 太原 030000；2.忻州市沐野食用菌研究所，山西 忻州 034000）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus） 在分类上属于真菌门（Eumycophyta） 担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 蘑菇属（Agaricus）。双孢蘑菇是世界上可人工栽培的食用菌中栽培最广泛、栽培量最大和消费最多的品种[1］。近年来我国双孢蘑菇产业发展迅速，生产量在栽培食用菌中居第2位，是我国出口创汇的主要食用菌之一。目前我国栽培的自主品种为As2796、W2000等品种，其他为国外引进品种。

现阶段双孢蘑菇选育所面临的主要问题是野生双孢蘑菇种质资源匮乏，中国保存的栽培种质遗传背景狭窄，野生种质的收集、评价与创新利用研究力度不够，尚未选育出可替代As2796的新品种[2］。因此我国特有的双孢蘑菇野生资源收集和种质资源创制具有重大意义。据统计，我国具有较为丰富的蘑菇属种质资源，现阶段世界上已报道蘑菇属200余种，其中我国已记录43个种，2个变种。野生双孢蘑菇分为白色和棕色2种[3］。有文献报道在我国的西藏曾采集到白色野生双孢蘑菇，并进行了相关出菇试验[4］，但有关棕色双孢蘑菇的报道较少见到。

沐野1号菌株于2008年8月17日从五台山草地采集分离，该品种与现已审定的双孢菇品种不同之处在于:一是外形不同，沐野1号呈棕褐色，菇柄较长；二是口感独特，菇柄、菇盖嫩脆香，味道厚浓；三是在同等条件下，其出菇早，产量较高；四是该菌株便于栽培管理，秸秆畜禽粪便粗制发酵栽培即可，且其菌丝生长快、活力强，易于粗放管理；五是易于加工，便于保存，经晒干、烘干后味道浓香。沐野1号作为双孢蘑菇野生品种，具有广阔的市场前景。因此鉴定出该野生双孢蘑菇的品系，对于双孢蘑菇育种具有重要意义。本研究采用形态学和ISSR法，对该菌株进行了特异性分析研究。

1 材料与方法

1.1 野生资源采集与形态学分析

2008年8月17日在山西省五台县五台山高原草地采集到野生蘑菇样品，并分离培养出菌种，制作标本。对照品种由农业部微生物产品质量监督检验测试中心（武汉）提供。形态学分析是以新鲜标本为材料，对其进行形态特征观察[5-7］。

1.2 分子标记分析

1.2.1 DNA 提取

DNA提取样品，是将子实体分离，进行PDA培养，然后利用PD液体培养基培养菌丝体；DNA的提取方法采用CTAB法。

1.2.2 ITS-RFLP 分析

试验引物序列，由擎科生物技术有限公司合成，见表1，采用参考文献中的方法进行测定[8-11］。

表1 菌种鉴定所用ISSR引物Tab.1 ISSR primers for strain identification

将待检菌株菌丝体活化、培养，进行基因组DNA提取及质量检测，PCR扩增及电泳检测均按照中华人民共和国农业行业标准操作[8］。

（续表 1）

1.2.3 同源性分析

利用DNAMAM软件对野生蘑菇沐野1号菌株和双孢蘑菇已认定品种As4607、As2796、英秀一号、棕秀一号、蘑菇176、棕蘑1号和蘑加1号，以及山西省境内发现的菌株晋阳1号的ITS4和ITS5序列进行同源性比对，菌株编号见表2。

表2 对比菌株编号Tab.2 Number of comparative strains

2 结果与分析

2.1 菌株沐野1号的形态特征

菌株沐野1号的形态特征见图1。

图1 子实体及菌丝体形态Fig.1 Fruiting body and mycelium morphology

沐野1号菌株子实体（如图1所示） 为中等大小。菌盖直径3.3 cm～3.7 cm，初期呈半球形，成熟后近平展，表面为污白色，具有褐色纤毛状鳞片，菌盖中央鳞片密，边缘稍稀疏，菌盖边缘光滑，成熟后稍内卷。菌肉呈白色，厚度为0.8 cm～1 cm。菌褶离生，较密，不等长，成熟或干后呈黑褐色。菌柄长 4.5 cm～7.5 cm，粗 0.6 cm～1.2 cm，圆柱形，基部膨大，实心，表面平滑或有白色的短细小纤毛。孢子椭圆形至卵圆形， （4.6～6.3） μm× （6.3～8.7）μm，担子双孢，缘囊体多，尺寸为 （6.9～9.6） μm×（21.1～33.8） μm。

2.2 双孢蘑菇菌株的ISSR指纹图谱

双孢蘑菇菌株的ISSR指纹图谱见图2～图10。

图2 引物H3、H4、H5对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.2 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H3,H4 and H5(from left to right)

由图2～图10可以看出，利用49条引物对2个待检双孢蘑菇菌种进行了ISSR扩增，从中选取能够扩增出稳定特异条带的25条引物，分别为H3、H4、H5、H6、H8、H9、H12、H13、H14、H15、H16、H18、 H19、 H20、 H21、 H22、 H25、 H26、 H28、H33、P4、P19、P22、P25、P26。25 条引物对 9 个双孢蘑菇待检菌株均扩增出稳定的条带，其中多态性条带在1条～11条；25条ISSR引物对9个双孢蘑菇待检菌株共扩增出334条稳定性条带，其中多态性条带达303条，多态性比率为90.72%。

图3 引物H6、H8、H9对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.3 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H6,H8 and H9(from left to right)

图4 引物H12、H13、H14对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.4 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H12,H13 and H14(from left to right)

图5 引物H15、H16、H18对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.5 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H15,H16 and H18(from left to right)

图6 引物H19、H20、H21对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.6 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H19,H20 and H21(from left to right)

图7 引物H22、H25、H26对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.7 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H22,H25 and H26(from left to right)

图8 引物H28、H33、P4对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.8 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers H28,H33 and P4(from left to right)

图9 引物P19、P22、P25对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.9 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers P19,P22 and P25(from left to right)

图10 引物P26对双孢蘑菇菌株扩增的ISSR指纹图谱（从左到右）Fig.10 ISSR fingerprints of Agaricus bisporus strains amplified by primers P26(from left to right)

2.3 聚类分析

对扩增产物进行分析，将试验出现的稳定性条带进行统计，有条带的记为1，无条带的记为0，用NTSYS-pc 2.0软件进行聚类分析，结果见图11。

图11 双孢蘑菇待检菌株ISSR多态性的聚类图Fig.11 Dendrogram of polymorphism of ISSR isolated from Agaricus bisporus strains

由进化树可以看出，9种双孢蘑菇分为2大分支，待测菌株沐野1号和晋阳1号在同1个大分支上，已审定品种As4607、As2796、英秀一号、棕秀一号、棕蘑1号、蘑菇176和蘑加1号在同1个大分支上，与待检测菌株亲缘关系较远，而菌株沐野1号和晋阳1号亲缘关系相近，相似系数达0.75。

3结论

本文通过对双孢蘑菇“沐野1号”菌株形态和ISSR的分析表明，待鉴定的菌株沐野1号和山西境内发现的菌株晋阳1号聚为一大类，与其他所有对照菌株的相似系数为0.54，推测待鉴定菌株沐野1号和山西省境内发现菌株晋阳1号是不同于对照菌株的新菌株。同时，待认定菌株沐野1号与晋阳1号的相似性系数为0.75，推测待鉴定菌株沐野1号为不同的新品种。这为充实我国野生双孢蘑菇种质资源库、选育优良双孢蘑菇新品种奠定了基础，关于该菌株生长特性和栽培特点还需进一步研究。