2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血浆miR-577水平与脂代谢及胰岛素抵抗关系的研究

王 蕤,吴素萍,徐品颖

(1.首都医科大学附属北京安贞医院 临床营养科，北京100029;2.首都医科大学附属北京安贞医院 检验科，北京100029)

二型糖尿病(diabetes mellitus,type 2或T2DM)占所有糖尿病患者的90%以上，多发病于35-40岁的成年患者[1]。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)与T2DM存在明显关联性，临床数据显示，50%-75%的T2DM患者伴有NAFLD或血脂代谢异常，40-50%的NAFLD患者伴有不同程度的糖代谢异常[2]。文献报道，T2MD合并NAFLD患者存在更为严重的胰岛素抵抗和脂代谢紊乱，而高TG血症、肥胖及ALT升高增加T2DM合并NAFLD的发生风险[3，4]。这些提示T2MD与NAFLD存在密切的相关联系。微小RNA(MicroRNA，miR)属于转录本长度在22-25nt范围内的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，通过影响靶基因的转录和翻译来调控细胞的生长，分化，增殖和凋亡[5]。研究报道，循环miRNA-126在不同阶段T2DM患者中均呈低表达，而其表达下调可能与血管内皮功能障碍有关[6]。另有文献报道，白藜芦醇可通过上调miRNA-122表达、下调SPT蛋白表达而减少肝细胞中神经酰胺水平，从而治疗非酒精性脂肪肝。提示，miRNA在T2MD和NAFLD中发挥着一定作用[7]。本研究观察T2DM与T2DM合并NAFLD患者中的差异miRNA，分析其与T2DM合并NAFLD的风险关系，并探讨其与胰岛素抵抗和脂代谢的联系，为临床预防或治疗T2DM合并NAFLD提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究经医院伦理委员会批准后进行，所有患者均签署知情同意书。选取2015年12月至2017年1月间在首都医科大学附属北京安贞医院就诊的T2DM患者200例，其中男性152名，女性48名，平均年龄(40.3±15.8)岁，合并 NAFLD者104例，未合并 NAFLD 者96例，分别作为合并组(T2DM/ NAFLD)和对照组(T2DM)。T2DM按1999年WHO糖尿病诊断标准确诊，根据病史排除1型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊类型糖尿病。NAFLD按2006年中华医学会《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》确诊，根据病史排除酒精、病毒及药物性肝病引起的脂肪肝，同时排除系统性免疫功能疾病、肾脏心脏功能异常及恶性肿瘤等患者。

1.2 方法

1.2.1人体参数测量

所有患者测量身高、体重、腰围、臀围，计算体重指数(BMI)，BMI=体重/身高2(kg/m2)。

1.2.2血脂和血糖水平比较

患者禁食8-12 h，次日早晨抽取静脉血，检查空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(Fins)、餐后2 h血糖(2h PBG)、餐后2 h胰岛素(2h Ins)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbAIc)等指标，计算胰岛素抵抗指数(HomA-IR)，HomA-IR=FPG×Fins/22.5。

1.2.3RT-qPCR检测各组患者血浆miR-577水平

按照200 μl血浆加入1 000 μl QIAzol裂解试剂(QIGEN，德国)分离血浆总RNA，室温放置15 min，根据miRNeasy血清/血浆试剂盒(QIGEN，Germany)实验方法提取RNA。使用15 μl DEPC水来溶解总RNA。由一步PrimeScript miRNA cDNA合成试剂盒(Takara，日本)如前所述分离RNA合成cDNA。PCR参数设置：37℃/60 min和85℃/5 s。RT-qPCR：用SYBR Premix Ex TaqTM II(TakaRa，日本)制备20 μl RT-qPCR系统，并使用ABI 7500荧光定量PCR仪器 (Applied Biosystems，美国)进行扩增。PCR参数设置：95℃/30 s，90℃/5 s，65℃/30 s 40个循环。以U6为内参，2(-△△CT)法计算miR-577的相对水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 T2DM/ NAFLD和T2DM组临床特征比较

如表1所示，T2DM/ NAFLD和T2DM组年龄、性别、腰臀比及血压均无统计学差异；与T2DM组相比较，T2DM/ NAFLD组BMI明显升高(P<0.01)。

2.2 T2DM/ NAFLD和T2DM组生化指标比较

如表1所示，T2DM/ NAFLD和T2DM组TC、HDL-C及FBG差异无统计学意义；与T2DM组相比较，T2DM/ NAFLD组AST、ALT、TG、GGT、LDL-C、2hPBG、Fins、2h Ins、HbAIc(%)及HomA-IR均明显升高(P<0.05或P<0.01)。

表1 T2DM/ NAFLD和T2DM组临床特征及生化指标比较

2.3 T2DM/ NAFLD和T2DM组血浆miR-577水平比较

实时荧光定量PCR结果显示，与T2DM组相比较，T2DM/ NAFLD组血浆miR-577水平明显降低(P<0.01)，结果如图1所示。

2.4 各临床指标与T2DM/ NAFLD相关性分析

以T2DM是否合并NAFLD为因变量，以年龄、性别、腰臀比等临床特征以及AST、ALT、TG等生化指标作为自变量，采用单因素logistic回归分析，结果显示BMI、ALT、GGT、LDL-C、2hPBG、2h Ins、HbAIc(%)、HomA-IR及miR-577与NAFLD的发生有关(P<0.05或P<0.01)；多因素logistic回归分析结果显示BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR及miR-577是影响T2DM/NAFLD发生的独立危险因素(P<0.05或P<0.01)，见表2。

图1 T2DM/ NAFLD和T2DM组血浆miR-577水平比较

注：*P<0.01

2.5 血浆miR-577水平与T2DM/ NAFLD患者各临床指标的相关性分析

Pearson法分析miR-577与T2DM/ NAFLD其他独立危险因素的相关性，结果如图2所示，miR-577与ALT(r=-0.589，P=0.012)，LDL-C(r=-0.788，P<0.001)，2h Ins(r=-0.695，P=0.002)，HomA-IR(r=-0.696，P= 0.001)呈负相关，与BMI不相关。

表2 各临床指标与T2DM/ NAFLD相关性分析

图2 T2DM/ NAFLD患者血浆miR-577水平与ALT，LDL-C，2h Ins，HomA-IR相关性分析

3 讨论

miR-577作为miRNA的一种，参与了恶性肿瘤、骨关节炎及胰腺β细胞功能的调控[8-10]。文献报道，miR-577可靶向作用于人成纤维细胞生长因21(FGF-21)，抑制FGF-21诱导的胰岛细胞胰岛素分泌[10]。Li[11]等也证实了miR-577对FGF-21存在靶向作用。FGF-21主要由肝脏和脂肪组织产生，其通过分泌入血对体内代谢过程进行调节，如糖脂代谢、胆固醇、胆汁酸合成及维生素代谢等[12]。这些提示，miR-577可能影响糖脂代谢、胆固醇、胆汁酸合成等生理活动。但目前还未有临床研究报道miR-577与T2DM合并NAFLD的关系。本研究通过分析T2DM组与T2DM合并NAFLD组患者临床特征及血脂血糖生化指标差异，发现T2DM合并 NAFLD组患者BMI、AST、ALT、TG、GGT、LDL-C、2hPBG、Fins、2h Ins、HbAIc(%)及HomA-IR均明显升高，血浆miR-577水平显著降低。进一步分析数据发现BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR及miR-577是影响T2DM合并 NAFLD发生的独立危险因素。研究报道，BMI、TC、HomA-IR、FGF -21是影响NAFLD发生的独立危险因素[13]。另有文献显示，TG、BMI、ALT是T2DM合并 NAFLD的主要危险因素[4]。本研究与文献报道存在共性与联系，同时也存在差异结果。这可能与样本量及患者生活环境存在一定的关系。基础研究显示miR-577与FGF-21存在靶向性，而FGF -21是影响NAFLD发生的独立危险因素[4,10]，提示miR-577可通过影响FGF-21的生物学效应进而影响NAFLD的发生。NAFLD患者为T2DM的高发人群[4]。这些将miR-577与T2DM合并 NAFLD相联系，为本研究中“miR-577是T2DM合并 NAFLD发生的独立危险因素”提供了理论支撑。

本研究中miR-577与BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR均为T2DM合并 NAFLD发生的独立危险因素。为了解miR-577与BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR的关系，本研究采用Pearson法对上述指标进行了相关性分析，结果显示miR-577与ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR呈负相关，而与BMI不相关。在离体细胞实验中，miR-577可抑制胰岛β细胞分泌胰岛素[10]。而本研究中T2DM合并 NAFLD组miR-577表达较T2DM组患者明显降低，而HomA-IR和2h Ins显著上升，这可能与miR-577对胰岛β细胞分泌胰岛素的抑制作用降低有关。HomA-IR是影响NAFLD发生的独立危险因素[13]。提示，miR-577降低可能是T2DM人群发生NAFLD的影响因素。本研究中miR-577和ALT及LDL-C呈负相关，这直接提示miR-577与脂代谢有关。

综上所述，血浆miR-577水平降低是T2DM发生NAFLD的独立危险因素，miR-577可能通过影响ALT、LDL-C和胰岛素分泌发挥作用。近年来，作为人类体内庞大的一类基因表达调控因子，miRNA的研究逐渐被科研工作者所重视。miRNA的功能涉及神经系统、内分泌系统、血液循环系统及消化系统，参与机体生长发育、免疫调节、激素分泌等[14-17]。同时，miRNA在许多疾病中异常表达，而针对异常表达的miRNA采取相应的治疗措施可能是控制疾病发展的有效方法。本研究中T2DM合并 NAFLD患者血浆miR-577水平显著降低，针对miR-577表达或者功能调节有可能是治疗T2DM合并 NAFLD的新方法。但本研究中miR-577的功能作用还未完全明了，有待于进一步探讨。