血浆同型半胱氨酸水平与MTHFR基因变异的关联研究

隋小芳,徐 男,黄佳滨,费秀斌,陈尚君,王凤玲*

(1.佳木斯大学附属第一医院 老年病科；2.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯154002)

高同型半胱氨酸血症(HHcy)是由于同型半胱氨酸代谢相关的酶功能障碍引起的，血浆同型半胱氨酸水平大于或等于15.0 μmol/L被称作高同型半胱氨酸血症[1]。Hcy升高的常见原因有遗传、体内叶酸、维生素B6、B12缺乏、慢性肾功能不全及生活方式等因素[2]，但在发展中国家，有关该基因的遗传数据结果仍有争议，需进一步探讨。

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是由MTFHR基因编码的，MTHFR催化5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，是Hcy转化为蛋氨酸的必要条件,是蛋氨酸循环通路的关键酶[3,4]。HHcy最常见的遗传原因可能是C677T中C到T和A1298C中A到C的转换[5]。但是在MTHFR(C677T和A1298C)中，突变的频率和酶的活性受不同的种族和地理位置的影响，存在一定的差异[6,7]。

综上，本研究旨在通过随机招募长期居住在佳木斯城区且没有血缘关系的汉族中、老年人，经病例对照设计研究，探讨中国东北人群血浆同型半胱氨酸水平与MTHFR基因变异的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究总共随机纳入466例受试者，均为长期居住在我国东北，佳木斯城区且没有血缘关系的汉族人群；平均年龄(63.11±8.53)岁，男性231名。受试者在2016年10月至2017年3月经佳木斯大学附属第一医院招募进入临床检查并分组，高同型半胱氨酸血症组(HHcy组)有206例、正常同型半胱氨酸血症组(Hcy组)有260例受试者。

高同型半胱氨酸血症的诊断标准：Hcy≧15 μmol/L[1]。所有受试者排除肝功能不全、肾功能不全、和恶性疾病患者，以及排除一些潜在的混杂因素。本研究已经通过佳木斯大学附属第一医院伦理委员会的认可，且已经获得所有研究对象的知情同意书，同意提供外周静脉血做基因型检测分析。

1.2 实验方法

1.2.1同型半胱氨酸检测

所有受试者空腹8 h后采集静脉血5 ml于紫色抗凝真空采血管中，采用循环酶法测得受试者血浆同型半胱氨酸水平。

1.2.2基因型检测

采集所有受试者静脉血2 ml于紫色抗凝真空采血管中，放置-20℃冰箱中冷藏保存。DNA提取使用传统的实验方法(酚氯仿方法)。采用聚合酶链式反应-限制片段长度多态性对SNP进行基因型分析，并用高分辨溶解曲线进行基因型分析。为了保证基因分型的质量，我们随机选择了3个基因型样品进行直接测序,未见差异。

1.3 统计学处理

本研究中进行的所有数据统计检验均为双尾，P<0.05认为有统计学差异。应用软件SPSS 19.0进行数据的处理和统计学分析。哈迪温伯格平衡检验验证样本的群体代表性；样本均值的组间比较使用t检验，分类变量用频数表示；运用χ2检验分析C677T突变、A1298C突变与受试者的一般临床资料；通过SHEsis在线软件分析比较HHcy组与Hcy组人群中基因组合(单倍型)的交互作用。

2 结果

2.1 两组研究对象临床基线数据的比较

所有研究对象的临床基线数据及其既往所患疾病的信息，见表1。两组的男/女性别比较(143/63 vs.88/172，P<0.01),两组的年龄比较(65.15±9.03 vs.62.37±8.20，P=0.04)，进一步将年龄按照WHO年龄划分标准分为：中青年(40-59 岁)、年轻老年人(60-69 岁)、老年人(>70 岁)的界限分组，分析结果仍有统计学意义(P<0.01)；在空腹血糖和胆固醇等临床指标无明显差异(P>0.05)。

表1 两组研究对象在临床基线数据的比较

注：M:男,F:女,Hcy:同型半胱氨酸TG:甘油三酯,TC:总胆固醇,LDL:低密度脂蛋白,HDL:高密度脂蛋白,T2DM:2型糖尿病,HTN:高血压.*表示P<0.05.

2.2 MTHFR C677T和A1298C的基因型和等位基因频率的单独关联分析

MTHFRC677T和A1298C基因中的基因型和等位基因频率在HHcy组、Hcy组间的比较，见表2和表3。在C677T中与正常Hcy组比较，HHcy组TT基因型明显增高(47.58% vs.21.92%，P<0.01)、T等位基因频率明显高于正常Hcy组(69.17% vs.50.58%，P<0.01)，差异有统计学意义；在A1298C中，HHcy组CC基因型明显低于正常Hcy组(1.94% vs.8.85%，P<0.01)、C等位基因频率显著低于正常Hcy组、A等位基因频率高于正常Hcy组，分别为(19.90% vs.26.54%)、(80.10% vs.73.46%，P=0.02)，差异有统计学意义。

表2 两组MTHFR C677T基因多态性的基因型及等位基因频率分布

注：OR:比值比，CI:置信区间；P<0.05有统计学意义。

表3 两组MTHFR A1298C基因多态性的基因型及等位基因频率分布

注：P<0.05为有统计学意义。

2.3 比较高同型半胱氨酸血症携带者中基因组合(单倍型)的交互作用

将MTHFR C677T和A1298C两位点的基因组合(单倍型)结果见表4。结果显示：HHcy组与Hcy组比较时，C677T的C和A1298C的A存在正向交互作用[P=0.003，OR(CI)=0.634(0.469-0.859)<1]，C677T的C和A1298C的C存在正向交互作用[P<0.01,OR(CI)=0.440(0.298-0.648)<1]；C677T的T和A1298C的A存在正向交互作用[P<0.01,OR(CI)=1.842(1.418-2.394)>1]；C677T的T和A1298C的C无正向交互作用[P=0.055,OR(CI)=1.586(0.988-2.546)>1]，无统计学意义。

表4 MTHFR C677T和A1298C两位点的基因组合(单倍型)与HHcy组和Hcy组之间的比较

注：@基因单倍型的多态性顺序：C677T和A1298C，通过使用SHEsis在线分析软件测得χ2和P值。

3 讨论

高同型半胱氨酸血症(HHcy)是基因和遗传因素共同调控的结果[8]。MTHFR C677T基因多态性中C等位基因到T等位基因的替换过程中，MTHFR酶活性分别降低了70%和35%左右，进而Hcy水平增高[9,10]。在A1298C基因位点中，Zappacosta1等人的研究结果表明AA基因型的人群Hcy普遍高于CC型，Jadeja等人研究表明A1298C基因多态性与HHcy明显相关[11,12]。在本次研究结果显示A1298C基因多态性中携带AA基因型的人群数量普遍高于CC型，并且1298A可能与HHcy相关，研究结果与前人相同。在两位点(C677T和A1298C)的交互作用分析中，C677T的C和A1298C的A、C677T的C和A1298C的C的交互作用，可能是高同型半胱氨酸血症的保护因素，而C677T的T和A1298C的A交互作用，可能是高同型半胱氨酸血症的致病因素。但未来需要扩大样本量深入研究。

综上所述，本研究表明高同型半胱氨酸水平与MTHFR 677T和1298A基因变异有关。