米诺环素对氟尿嘧啶诱导的小鼠肠黏膜炎的保护作用研究

黄义新 刘炜

[摘要] 目的 研究米诺环素对氟尿嘧啶（5-Fu）诱导的肠黏膜炎的保护作用。 方法 40只雄性Balb/c小鼠，随机分为5组，正常组、模型组、米诺环素低剂量组及高剂量组，每组10只。模型组由连续腹腔注射5-Fu（80 mg/kg）3 d诱导，治疗组同时灌胃给予30 mg/kg或60 mg/kg的米诺环素。测定小鼠体质量、腹泻指数，同时对小鼠空肠进行HE染色，测定小肠黏膜中的促炎性细胞因子，并对小鼠肠内容物中的短链脂肪酸进行测定，进而评价米诺环素对小鼠肠黏膜炎的保护作用。 结果 高剂量米诺环素可显著增加肠黏膜炎模型小鼠的体重（P < 0.01），降低其腹泻指数（P < 0.01），增加模型小鼠的空肠绒毛长度（P < 0.01）。此外高剂量米诺环素可显著抑制肠黏膜中的IL-6（P < 0.05）和TNF-α（P < 0.01）的表达，同时增加小鼠肠内容物中丁酸及乙酸的含量（P < 0.01）。 结论 米诺环素具有确切的肠黏膜保护作用，其作用与其抗炎及促进短链脂肪酸的生成有关。

[关键词] 米诺环素；氟尿嘧啶；肠黏膜炎；短链脂肪酸

[中图分类号] R730.53 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（a）-0020-05

Protective effects of Minocycline on 5-Fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice

HUANG Yixin LIU Wei

Department of Pharmacy， Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100038， China

[Abstract] Objective Forty investigate the protective effect of Minocycline on 5-Fu induced intestinal mucostitis. Methods 40 male Balb/c mice were randomly divided into four groups （n = 10）， Control group， 5-Fu induced mucositis model， high dose or low dose of Minocycline treated group. After the mice were intraperitoneal administrated with 80 mg/kg 5-Fu for 3 days and simultaneously treated with 30 or 60 mg/kg orally in Balb/c mice， the body weight loss， diarrhea scores， and HE stain of the intestinal， pro-inflammatory cytokines in intestine tissue and short chain fatty acids in colon contents were also determined. Results Data from this study indicated that high dose minocycline could attenuate the 5-Fu induced body weight loss （P < 0.01）， and lower the diarrhea scores （P < 0.01）. Also minicycline in high dose increased the intestinal vill length （P < 0.01）， decreased the IL-6 （P < 0.05） and TNF-α （P < 0.01）. In the colon contents， Minocycline could significantly increase the SCFAs concentration， especially for aceticacid butyricacid （P < 0.01）. Conclusion All these results demonstrated that Minocycline exert protective effects on 5-Fu induced intestinal damage in mice， and these protective effects may partially oriented from its anti-inflammatory effects and enhancing short chain fatty acid production.

[Key words] Minocycline； 5-Fluorouracil； Intestinal mucositis； Short-chain fatty acid

米諾环素为常见的四环素类抗生素，其抗菌谱广、抑菌活性强且持久[1]，目前临床上多用于治疗支原体感染、尿道感染、支气管炎、毛囊炎等[2-3]。因米诺环素具有较好的脂溶性，口服生物利用度较高，可分布于全身各组织，尤其可透过血脑屏障等生理性屏障[4]。近年来，有研究表明米诺环素具有抗炎、抗凋亡等作用，可显著抑制炎症、应激、脑出血等诱导的神经损伤[5]。

氟尿嘧啶（5-Fu）为临床上常用的化疗药物[6]，可用于治疗消化系统肿瘤、乳腺癌等[7-8]，但其胃肠道不良反应明显，可引起化疗患者食欲减退、腹泻、便血等，严重限制了其临床应用[9]。研究表明这些不良反应可能与5-Fu诱导肠黏膜损伤，进而引起炎性反应有关[10-11]。此外，5-Fu还可引起肠道菌群失衡，导致肠内容物中短链脂肪酸的减少，而短链脂肪酸，如丁酸等具有支撑肠上皮细胞屏障的功能[10，12]。

寻找具有抗炎及保护肠黏膜功能的药物，进而降低5-Fu的胃肠道不良反应，这对改善化疗患者的生活质量和化疗效果具有重要意义[8]。本文拟研究米诺环素对5-Fu诱导的小鼠肠黏膜炎的保护作用，以期为相关药物的开发及拓宽米诺环素的临床应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 5-Fu、米诺环素、四甲基戊酸购自美国Sigma公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸购自德国Ehrenstorfer公司；磷酸及乙酸乙酯（GC-MS级）均由德国Merk公司提供；小鼠TNF-α和IL-6 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（批号分别为B226815， B229138）由美国Biolegend公司提供。实验用水为超纯水，由Milli-Q Gradient A10制备。实验中其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂厂。

1.1.2 实验动物 SPF级Balb/c小鼠由扬州大学比较医学实验中心提供，合格证号为SKXK（苏）2012-0004，小鼠雌雄各半，8～10周龄，体重18～22 g。动物伦理由首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准，符合相关规定。动物饲养于温度为24～26℃房间中，每天7：00～19：00给予光照，动物自由饮食饮水。小鼠每天早上抓握半分钟适应1周后，进行后续的动物实验。

1.1.3 实验仪器 Thermo 2IR型高速低温离心机，Olympus显微镜（含DP2-BSW计算机图像分析系统），BS323S 电子天平（Sartorius公司，精确值0.0001 g），酶标仪（Biotek公司），GC6890N型气相色谱仪，配有 FID 检测器（美国Agilent公司），涡旋振荡器（Scientific Industries Inc. USA）。

1.2 方法

1.2.1 药物的配制 5-Fu用生理盐水配置成8 mg/mL的溶液（必要时加热至50℃溶解后，冷却备用），米诺环素采用0.5%羧甲基纤维素钠溶液混悬为3 mg/mL和6 mg/kg的混悬液备用。

1.2.2 小鼠肠黏膜炎的诱导及给药方案 40只SPF级Balb/c小鼠，采用完全随机分组法将动物随机分为正常组、模型组、米诺环素低剂量组合米诺环素高剂量组，每组动物各为10只，雌雄各半。正常组小鼠每天腹腔注射生理盐水10 mL/kg，模型组前3 d每天腹腔注射配制好的5-Fu10 mL/kg（即给药剂量为80 mg/kg），米诺环素给药组在造模1 h后，灌胃给予相应剂量的米诺环素药液进行药物干预[9]。

于第7天，取各组小鼠的空肠，经生理盐水冲洗干净肠内容物后，取约1 cm的空肠置于10%的中性甲醛中，固定；其余的空肠，纵向剖开，平铺于冰板上，采用载玻片刮下肠黏膜备用；同时收集小鼠盲肠内容物，用于后续的短链脂肪酸的测定。

1.2.3 小鼠体重及腹泻指数 每隔1 d（0、1、3、5、7 d）记录1次体重；腹泻情况通过对粪便进行评分[13]，具体如下：0分：粪便正常或未见粪便；1分：轻度腹泻，粪便有轻微湿软；2分：中度腹泻，粪便不成形，且较为湿润较湿，且伴有轻度的肛周粪便着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。通过比较各组动物的腹泻指数及体重情况进行药效评价。

1.2.4 HE染色剂及肠上皮绒毛长度 经中性甲醛固定的空肠，经过常规取材，脱水，石蜡包埋，切片后进行常规的HE染色，并在显微镜下观察小肠病理变化，同时进行评分。主要包括肠黏膜上皮细胞有无变性、坏死，绒毛间质是否水肿；黏膜固有层的炎细胞浸润情况；黏膜下层、肌层、浆膜层有无充血、水肿、炎细胞浸润等损伤。根据上述病变的严重程度分别记分为0分（无明显病变）、0.5分（轻微病变）、1分（轻度改变）、2分（中度病变）、3分（较为严重），通过累加所有分数，得出总的病变评分[10，13]。

小肠绒毛长度的测定采用在200倍光镜下利用显微镜自带的图像分析系统（DP2-BSW）测量，随机选择3～5各视野，计算每个视野下所有肠绒毛长度的平均值，进一步计算所有视野中的肠绒毛长度均值，进行后续的统计分析。

1.2.5 小鼠肠黏膜中TNF-α和IL-6的测定 取小鼠空肠的肠黏膜约50 mg，加入9倍体积的冰磷酸缓冲液（PBS，pH=6.8），冰浴下匀浆，12 000 g离心5 min，取上清，按小鼠TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒操作步骤进行。同时上清液采用BCA法定蛋白，用于校正肠黏膜中的细胞因子浓度（pg/mg蛋白）。

1.2.6 肠内容物中短链脂肪酸测定 精密称取约0.1 g的肠内容物，加入9倍体积的0.5%的磷酸水溶液，在4℃条件下剧烈涡旋2 min使肠内容物充分分散，12 000 g离心5 min，取上清0.5 mL，加入10 μL內标（200 μg/mL的四甲基戊酸）和0.5 mL乙酸乙酯，4℃涡旋2 min后，15 000 g离心10 min，取乙酸乙酯层，进行GC-FID分析。

GC-FID分析中，色谱柱为PEG-20型弹性石英毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升温：0～5 min，85～160℃（15℃/min）；5～15 min，150～230℃（8℃/min）；15～18 min，230℃，保持3 min；18～21 min，230～170℃（20℃/min）；检测器温度270℃；进样口温度220℃；分流进样，进样量1.0 μL；载气为高纯氮气，流速2.1 mL/min。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 13.0对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料用率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 体重及腹泻评分

与正常组小鼠比较，腹腔注射5-Fu后，模型组小鼠给药后体重显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。而给予30 mg/kg或60 mg/kg的米诺环素后，小鼠体重与模型组相比，显著增加，其中米诺环素高剂量组效果最佳。见表1。

从腹泻指数上看，模型组小鼠在造模前2 d未见明显的腹泻症状，从3 d开始可见轻微的腹泻，随着时间的延长，模型组小鼠腹泻指数显著增加。而给予30、60 mg/kg米诺环素后，小鼠的腹泻情况可见明显改善，其中米诺环素低剂量组在第5天和第7天的腹泻指数与模型组相比，显著降低（P < 0.05），而米诺环素高剂量组在第3天开始，其腹泻指数显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.2 小肠病理及肠上皮绒毛长度统计结果

正常组小鼠空肠结构完整，可见清晰的黏膜层，黏膜下层、肌层和浆膜层绒毛细长且排列规则整齐。而模型组小鼠空肠结构可见上皮细胞出现轻度或者中度的变性，且有部分小鼠空肠出现水肿，从固有层看，有一定的充血，且出现炎症细胞的浸润[6]。而给予不同剂量的米诺环素后，上述病理改变可见明显改善。见图1。

从病理学评分上看，正常组小鼠未见明显病理学改变，但5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的空肠，其病变评分显著增加。给予30 mg/kg和60 mg/kg的米诺环素后，其病变评分显著降低（P < 0.05或P < 0.01），提示米诺环素具有一定的保护5-氟尿嘧啶诱导的肠黏膜损伤的作用。进一步测定其绒毛长度，模型组绒毛长度显著降低（P < 0.01），而给予不同剂量的米诺环素后，可显著改善由5-Fu诱导的绒毛损伤（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

2.3 TNF-α和IL-6测定结果

与正常组小鼠肠黏膜中的TNF-α表达情况相比，模型组小鼠血浆中的TNF-α表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。IL-6的含量在模型组小鼠肠黏膜中亦显著增加（P < 0.01）。给予米诺环素后，低、高剂量的米诺环素均对5-Fu诱导的小鼠肠黏膜炎症损伤有改善作用（P < 0.05或P < 0.01）。见表4。

2.4 盲肠内容物中短链脂肪酸含量

与正常组小鼠肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸、及戊酸的浓度相比，5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠盲肠内容物中上述四种短链脂肪酸含量显著下降（P < 0.01）。而给予低剂量米诺环素后，小鼠盲肠中的乙酸含量与模型组相比，显著增加（P < 0.05），其他短链脂肪酸均有所增加但差异无统计学意义（P > 0.05）。给予高剂量米诺环素后，小鼠盲肠中的乙酸、丙酸、丁酸的含量则显著提高，其中乙酸和丁酸含量显著提高（P < 0.01）。见表5。

3 讨论

本实验通过对小鼠体重、腹泻评分、空肠病变及绒毛长度、肠黏膜中促炎性细胞因子含量及盲肠内容物中的短链脂肪酸，研究米诺环素对5-氟尿嘧啶诱导的肠黏膜炎小鼠保护作用。实验结果表明米诺环素具有较好的保护作用。

研究表明化疗药物，如5-Fu可通过直接损伤肠上皮细胞，诱导肠上皮细胞凋亡，进而发生炎症级联反应，诱导肠黏膜损伤[8]，进而导致腹泻、呕吐、便血等系列胃肠道不良反应，严重限制了其临床应用。本研究选择米诺环素作为研究对象，基于其具有一定的抗菌作用、抑制神经炎症等文献报道[2，4]，发现米诺环素可显著改善5-Fu诱导的小鼠体重减轻及腹泻症状。进一步从病理学及肠绒毛长度发现，米诺环素可显著改善5-Fu诱导的小肠病变和绒毛萎缩。

由于5-Fu诱导的肠黏膜损伤可能与炎性反应和菌群失调等有关[6，8，10]，本研究进一步的通过ELISA研究米诺环素对肠黏膜中的促炎性细胞因子TNF-α和IL-6表达的影响，结果提示米诺环素可显著抑制上述促炎性细胞因子的表达，这与米诺环素抑制LPS诱导的小胶质细胞活化等结果类似，进一步佐证了米诺环素的抗炎作用。

此外，由于肠黏膜损伤可能还与肠道菌群紊乱及其继发的短链脂肪酸（SCFAs）生成减少有关[14-16]，SCFAs为食物中膳食纤维经肠道菌群发酵后的降解产物，可为肠上皮细胞提供能量[17]，进而维护肠道上皮细胞的屏障功能，保护小肠杯状细胞的分泌功能完好[18]，同时还可以促进肠黏膜细胞的增殖[19]。本研究通过检测盲肠内容物中的SCFAs的浓度，研究结果提示，米诺环素可显著提供小鼠结肠中的丁酸的含量，而丁酸具有确切的促进肠上皮细胞增殖，保护肠上皮细胞损伤的功效[20]，这从另外一个方面确证了米诺环素对5-Fu诱导的肠黏膜炎的保护作用。

本研究对拓宽米诺环素的临床应用，寻找较好的改善5-Fu化疗的辅助用药具有重要意义，后续应对米诺环素的保护作用机制进行深入研究。

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（收稿日期：2018-08-31 本文编辑：苏 畅）