一种特异性靶向上皮细胞黏附分子EpCAM的小肽的鉴定

朱一超 马晓雯 何磊

[摘要] 目的 鉴定前期获得的一个食管腺癌特异性靶向小肽的靶分子。 方法 小肽Pull Down和质谱筛选该小肽的可能靶分子；计算机模拟分子对接、Western blot、激光共聚焦显微镜、流式细胞术、siRNA干扰、基因转染等方法确认靶分子的正确性。 结果 上皮细胞黏附分子（EpCAM）是该小肽的特异性结合靶分子，且该小肽可特异性结合EpCAM高表达的结肠癌细胞和组织。 结论 除了食管腺癌，该小肽在EpCAM高表达的结肠癌中也具有早期诊断和靶向治疗的潜在应用价值。

[关键词] EpCAM；多肽；分子成像；肿瘤靶向治疗

[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（a）-0004-04

Identification of a small peptide targeting epithelial adhesion molecule EpCAM

ZHU Yichao1 MA Xiaowen2，3 HE Lei2 ZHOU Jiming2，4 PANG Zhijun2 ZHANG Xinlei2 MAO Zhuang1 LI Meng2

1.The Brigade of Undergraduates， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an 710032， China； 2.School of Pharmacy， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi′an 710032， China； 3.Department of Pharmacology， General Hospital of Ji′nan Military Region， Shandong Province， Ji′nan 250000， China； 4.Department of Cardiology， the 153rd Central Hospital of People′s Liberation Army， He′nan Province， Zhengzhou 450000， China

[Abstract] Objective To find the molecular target of an esophagus adenocarcinoma specific binding peptide （SNF*）. Methods Pull Down and Mass Spectrum were used to identify the potential target； molecular docking， Western blot， laser scanning confocal microscopy， flow cytomertry， RNA interference and gene transfection were used to verify the target of SNF*. Results Epithelial adhesion molecule （EpCAM） was the potential target of SNF*. SNF* specifically bound with EpCAM which overexpressed in colon cancer cells and tissues. Conclusion Except esophagus adenocarcinoma， SNF* can be used in the early diagnosis and targeted therapy in colorectal cancer with high EpCAM expression.

[Key words] EpCAM； Peptide； Molecular imaging； Tumor targeted therapy

利用腫瘤与正常组织的分子表型差异，筛选特异肿瘤组织探针在肿瘤早期诊断和靶向治疗中具有重要作用[1-2]。特异性肿瘤组织探针的类型很多，包括抗体、多肽、模拟肽、核酸等[3]。抗体在肿瘤早期诊断和靶向治疗中的作用不言而喻，它们可以偶联放射性核素进行肿瘤早期成像，偶联抗肿瘤药物实现靶向治疗。然而，抗体的应用存在很多局限性。比如，抗体重链容易被网状内皮系统捕获，造成肝、脾和骨髓毒性[4-5]；抗体分子大，很难进入实体瘤内部等等。相对于抗体的这些缺陷，靶向性小肽具有分子小、免疫原性低、血浆清除快、肿瘤渗透性高等优点[6]，且小肽生产成本低，更易大规模生产。前期，我们通过噬菌体肽库筛选获得了一条能够特异性结合食管腺癌的七肽（SNFYMPL，SNF*）。该七肽可特异结合早期食管腺癌组织，在食管腺癌早期内镜诊断和靶向治疗中具有潜在用途[7]。然而我们尚不清楚该小肽具体与肿瘤细胞表面什么靶分子结合。本研究中，我们希望鉴定并确认该小肽的靶分子，为该小肽的应用奠定理论基础，并根据靶分子的表达研究，扩展该小肽的应用范围。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和组织来源

食管腺癌细胞OE33，结肠癌细胞HT29、SW480、SW620，结肠上皮细胞NCM460均培养于RPMI1640。巴雷特食管上皮细胞Q-hTERT培养于角质细胞无血清培养基（Life Technologies）。结肠癌以及癌旁组织取自空军军医大学唐都医院，患者知情同意。本研究方案通过空军军医大学伦理委员会批准。

1.2 多肽Pull Down

SNF*偶联于EAH Sepharose 4B（GE Healthcare）。对照多肽GGGSK以同样方式偶联，制备SNF*-EAH和GGG*-EAH凝胶柱。OE33和Q-hTERT细胞裂解（pH 7.5，1% Triton X-100）后上柱（1 mg/mL），4℃过夜，1 mol/L NaCl洗脱，SDS-PAGE电泳分离，硝酸银染色。部分洗脱液电泳后，进行Western blot鉴定。

1.3 计算机模拟分子对接

RCSB PDB蛋白数据库获得EpCAM晶体结构（PDB ID：4MZV）。Discovery Studio 3.5软件进行SNF*与EpCAM的模拟对接。

1.4 siRNA干扰和EpCAM基因转染

EpCAM干扰序列如下，siRNA1：5′-GCCGUAA-ACUGCUUUGUGATT-3′，5′-UCACAAAGCAGUUUA-CGGCTT-3′；siRNA2：5′-GACAAGGACACUGAAAU-AATT-3′，5′-UUAUUUCAGUGUCCUUGUCTT-3′；对照序列为：5′-CUAGCUAGGTTUCCAUTCCTT-3′，5′-AUCGCCUTTCGGUAUAUTCTT-3′。转染试剂为Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）。EpCAM的DNA编码区由上海吉玛公司合成，转染质粒为pcDNA3.1。突变型EpCAM序列是将预测的SNF*结合位点删除的序列，转染步骤同上。

1.5 实时定量PCR

TRIzol试剂提取总mRNA，采用iTaq Universal SYBR Green Supermix法在qRT-PCR仪上进行实时定量分析。EpCAM引物如下：5′-ATAACCTGCTCTGAGCGAGTG-3′；5′-TGCAGTCCGCAAACTTTTACTA-3′，β-actin为内参。

1.6 激光共聚焦显微镜

细胞培养于4孔细胞培养载玻片，待生长至80%满时，血清封闭，PBS清洗，SNF*-FITC多肽（0.5 mmol/L）孵育1 min。洗涤后多聚甲醛固定，DAPI染色，激光共聚焦显微镜（Fv1000，OLYMPUS）观察。Cy3-EpCAM抗体染色时，细胞先进行固定和封闭，4℃孵育过夜。

1.7 流式细胞术

细胞胰酶消化分离，20%山羊血清封闭，0.1 mmol/L SNF*-FITC 4℃孵育40 min，甲醛固定，PBS洗涤，流式细胞仪（FACSCalibur，Beckton Dickinson）分析，Flowjo软件作图。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNF*靶分子的鉴定与验证

银染结果显示OE33与SNF*-EAH孵育后的洗脱液中有一新生条带（图1A，方框处）。质谱给出12个可能的候选蛋白。Western blot显示12个分子中只有EpCAM抗体能够识别该新生条带（图1B）。分子对接显示SNF*与EpCAM结合如下：丝氨酸与EpCAM的173位Arg形成两个氢键，结合半径0.27、0.31 nm；丝氨酸与174位Tyr形成氢键，结合半径0.24 nm；天冬氨酸与233位Leu形成氢键，结合半径0.22 nm；甲硫氨酸与241位Asp形成氢键，结合半径0.2 nm（图1C、D）。

2.2 EpCAM敲减明显降低SNF*与OE33的结合

EpCAM的siRNA明显降低EpCAM在OE33的表达（P < 0.01）（图2A，封三）。激光共聚焦显示：EpCAM敲减后，SNF*-FITC、Cy3-EpCAM抗体与细胞的结合明显减弱（P < 0.01）（图2B～E，封三）。流式细胞术显示类似结果（图2F～G，封三）。

2.3 SNF*与EpCAM过表达的Q-hTERT细胞的结合

EpCAM被过表达于Q-hTERT细胞（P < 0.01）。另外，173位Arg、174位Tyr、233位Leu敲除的EpCAM（mEpCAM）也被过表达于Q-hTERT（P < 0.01）（图3A，封三）。激光共聚焦显示：SNF*可以识别EpCAM转染的细胞，而不识别mEpCAM转染的细胞（P < 0.01）（图3B～C，封三）。EpCAM单抗（识别位点为第250～314位氨基酸）可明显结合两种转染细胞（图3D～E，封三）（P < 0.01）。流式细胞术显示类似结果（图3F～G，封三）。

2.4 SNF*-FITC与EpCAM高表达的结肠癌细胞和组织特异性结合

Western blot和qRT-PCR显示与正常结肠上皮细胞NCM460比较，HT29、SW480和SW620高表达EpCAM（P < 0.01）（图4A，封三）。激光共聚焦显示：SNF*-FITC特异性结合HT29、SW480和SW620；EpCAM敲除明显降低SNF*-FITC和Cy3-EpCAM抗体对细胞的结合（P < 0.01）（图4B～C，封三）。通过免疫组化分析，我们获得19例EpCAM高表达的结肠癌组织和10例EpCAM低表达的癌旁组织。激光共聚焦显示相对于癌旁组织，SNF*-FITC和Cy3-EpCAM抗体与肿瘤的结合明显较高（P < 0.01）（图5，封三）。

3 讨论

EpCAM是单次跨膜糖蛋白[8]，主要参与钙黏蛋白介导的细胞黏附[9]，并能通过上调c-myc、cyclin A、cyclin E等分子促进细胞周期和细胞增殖[10-11]。EpCAM高表达于包括结直肠癌、食管癌、胰腺癌在内的多种上皮肿瘤[12-13]。欧盟在2013年批准了EpCAM抗体（Catumaxomab）治疗结肠癌引发的恶性腹水[14-15]。前期，我们证明SNF*特异性结合食管腺癌组织，能够在早期食管腺癌的内镜诊断中发挥重要作用[7]。本研究中，我们证明了SNF*的靶分子是EpCAM，又证明了SNF*可以与EpCAM高表达的结直肠癌细胞和组织特异结合，这大大拓展了SNF*在肿瘤早期诊断中的应用范围。未来，我们将进行SNF*在早期结直肠癌、胰腺癌的分子诊断及肿瘤药物靶向递送方面的研究。另外，小肽最大的问题是体内半衰期太短，过短的半衰期會导致它们在体应用时靶组织的聚集性降低[16-18]。未来，我们还要通过氨基端和羧基端的保护、D型氨基酸替代、PEG大分子保护等方法对该小肽的结构进行优化[19-20]，以便于其更好地应用于肿瘤早期诊断和靶向治疗。

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（收稿日期：2018-08-27 本文編辑：张瑜杰）