黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用

武 超，许杜娟,2，杨 翠，夏 泉,2，张医浩



黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用

武 超1，许杜娟1,2，杨 翠1，夏 泉1,2，张医浩1

目的 探讨黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞株(HepG2)增殖抑制作用及其可能机制。方法 采用MTT方法检测5-氟尿嘧啶单独或联合黄芪皂苷Ⅱ作用于细胞后，5-氟尿嘧啶对HepG2的抑制率；Hoechst33342染色检测细胞凋亡；Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-ERK)以及凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、活化凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved PARP)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cleaved caspase 3)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(Cleaved caspase 9)的表达。结果 MTT法结果显示，5-氟尿嘧啶呈浓度和时间依赖性抑制肝癌HepG2细胞增殖，联用黄芪皂苷Ⅱ可以显著增加5-氟尿嘧啶对HepG2细胞增殖抑制作用(P<0.05)；Western blot法结果显示，联合使用黄芪皂苷Ⅱ和5-氟尿嘧啶能增加Cleaved PARP表达(P<0.05)；Hoechst33342验证联合用药组较5-氟尿嘧啶组细胞凋亡水平升高；此外，Western blot结果还显示，黄芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2蛋白表达； 联用ERK1/2特异性抑制剂PD98059明显增加5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡率以及凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9表达(P<0.05)。阻断ERK1/2后，黄芪皂苷Ⅱ促进5-氟尿嘧啶诱导的凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9表达以及细胞凋亡水平并未明显增加。结论 黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用，其机制可能与抑制p-ERK1/2的表达有关。

黄芪皂苷Ⅱ；5-氟尿嘧啶；HepG2；细胞凋亡

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率占我国恶性肿瘤的第2位，每年约有22万人死于原发性肝癌[1]。5-氟尿嘧啶常用于治疗胃肠道恶性肿瘤，其对肿瘤抑制率降低是制约其疗效的重要原因。黄芪作为传统中草药，有补气升阳、利尿托毒、排脓生肌等功效[2]。研究[3]显示黄芪提取物有抗肿瘤活性，黄芪注射液、黄芪精口服液等药物已被广泛应用于临床参与联合抗肿瘤治疗[4]，但其具体抗肿瘤活性成分及机制仍不清楚。黄芪皂苷Ⅱ为黄芪皂苷的主要成分[5]，是否能有效联合抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶抑制肝癌细胞株HepG2增殖、增加其疗效目前尚未见报道。该研究旨在探讨黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药品与试剂 人肝癌细胞株HepG2(中国科学院上海生命科学院)；DMEM高糖培养基(美国Hyclone生物技术有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；黄芪皂苷Ⅱ(南京泽朗有限公司，纯度98%)；5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司)；Hoechst33342、甲基偶氮唑蓝(MTT)、ERK1/2特异性抑制剂PD98059(美国Sigma公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗、β-actin 抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；丝裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-ERK1/2)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cleaved caspase 3)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(Cleaved caspase 9)、凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抗体(美国Cell Signaling公司)。

1.2 检测指标和方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2采用10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 g/L链霉素的高糖DMEM培养基置于37 ℃、5%的CO2培养箱中贴壁生长，取对数期生长的细胞进行实验。

1.2.2 MTT法测定细胞活力 取对数生长期HepG2细胞株，0.25%胰酶消化后用DMEM培养基制成单细胞悬液，以5×103个/孔细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后吸弃上清液，加入预定药物培养；每组设5个复孔，每孔加入200 μl含药培养基。培养预定时间后，加入20 μl浓度为5 g/L的MTT溶液，继续在培养箱中培养4 h，吸弃上清液后每孔加入150 μl DMSO，微振荡器振荡10 min。以酶标仪于550 nm波长检测相应的吸光度，取各组均值，实验重复3次。

1.2.3 Hoechst33342法检测细胞凋亡 取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞数量至3×105个/孔，以每孔2 ml接种于6孔板，分组为对照组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)组，处理48 h后，弃去培养基，用PBS洗涤2次，4%低聚甲醛固定15 min，每孔加入PBS溶解的2 mg/L Hoechst33342 1 ml，避光15 min后，吸弃溶液，用PBS洗涤2次，荧光显微镜观察染色并拍照。

1.2.4 Western blot 检测PARP、Cleaved PARP、ERK1/2、p-ERK1/2、Cleaved caspase3、Cleaved caspase9蛋白表达 收集各组HepG2细胞，4 ℃预冷的PBS洗涤3次，加入400 μl蛋白裂解液(含100 mmol/L 的PMSF 4 μl)，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取蛋白上清液，加入5×蛋白上样缓冲液混合后煮沸10 min，收集总蛋白。SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离蛋白，然后转印至硝酸纤维素膜(PVDF)上。用5%脱脂牛奶封闭3 h后，加入常规一抗，4 ℃摇床过夜。TBST洗涤3次，加入相应二抗孵育1 h后，TBST洗涤3次，ECL化学发光显影，Bio-Rad照相系统进行照相并用Image-J软件进行图片分析。

2 结果

2.1 黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用 5-氟尿嘧啶按相应浓度(0、0.04、0.2、1、5、25、125、625 μmol/L)分别作用肝癌HepG2细胞24、48、72 h后，对肝癌HepG2细胞增殖呈浓度和时间依赖性抑制，见图1。黄芪皂苷Ⅱ(20、40、80 μmol/L)联用10 μmol/L 5-氟尿嘧啶作用48 h后，可以显著增加5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的抑制作用(F=87.43,P<0.05,P<0.01)，见图2。

2.2 黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞促凋亡作用 Western blot结果显示5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)组较5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组凋亡相关蛋白PARP出现明显裂解(F=517.3,P<0.05,P<0.01)，见图3。Hoechst33342染色分析各组细胞凋亡情况，结果显示5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)组较5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组细胞凋亡水平升高，见图3。

图1 5-氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用与同一时间点0 μmol/L 5-氟尿嘧啶组比较：#P<0.05，##P<0.01

图2 黄芪皂苷Ⅱ联合5-氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用

1：对照组；2：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组；3：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)组；4：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)组；5：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)组；与5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.3 黄芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2的表达 40 μmol/L黄芪皂苷Ⅱ分别作用HepG2细胞3、6、12、24、48 h后，Western blot检测各组p-ERK1/2、ERK1/2

图3 黄芪皂苷Ⅱ联合5-氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞促凋亡作用

A：对照组；B：.5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组；C：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)组；D：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)组；E：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)组；与5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组比较：#P<0.05，##P<0.01

表达，结果显示p-ERK1/2随作用时间增加而减少(F=35.48,P<0.05)，见图4。

图4 黄芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2蛋白的表达与0 h比较：#P<0.05，##P<0.01

2.4 联用PD98059增加5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的促凋亡作用 20 μmol/L PD98059联合10 μmol/L 5-氟尿嘧啶增加HepG2细胞内凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9的表达(F=195.5,P<0.05)；PD98059阻断ERK1/2通路后，黄芪皂苷Ⅱ对Cleaved caspase3、Cleaved caspase9促进作用并未明显增加。Hoechst33342染色分析结果与上诉结果一致，见图5。

3 讨论

化疗作为治疗肿瘤的重要手段被广泛运用于临床，而肿瘤细胞对化疗药物抵抗是造成疗效降低的重要原因。联合给药是解决临床化疗药物抵抗的重要方法之一，有较好的运用前景。黄芪作为传统中草药，其抗肿瘤的作用受到学者的广泛重视。黄芪多糖、黄芪皂苷等黄芪提取物的抗肿瘤特性已经成为目前抗肿瘤治疗的研究热点之一。

ERK1/2属于有丝分裂原激活蛋白激酶家族，作为肿瘤治疗的新靶点被广泛认知[6-7]。研究[7]表明ERK1/2可以通过细胞内信号转导级联参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等一系列生理活动。冯丹 等[8]发现抑制ERK1/2表达可以增加5-氟尿嘧啶抗人胃癌细胞增殖作用，谭雪梅 等[9]发现5-氟尿嘧啶联用ERK1/2特异性抑制剂PD98059可以增加5-氟尿嘧啶对小鼠黑色素瘤细胞的促凋亡作用。

本研究结果显示黄芪皂苷Ⅱ通过下调p-ERK1/2的表达增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用。合用ERK1/2特异性抑制剂PD98059后，黄芪皂苷Ⅱ对凋亡蛋白Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 9的表达促进作用并未显著增加，Hoechst33342染色结果也表明阻断ERK1/2可以增加5-氟尿嘧啶对HepG2的促凋亡作用。而PD98059作用后，黄芪皂苷Ⅱ对HepG2促凋亡作用并未显著增加。综上所述，黄芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用，其机制可能与抑制p-ERK1/2的表达有关。

图5 联用PD98059 增加5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的促凋亡作用 A：对照组；B：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组；C：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)组；D：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+PD98059(20 μmol/L)组；E：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黄芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)+PD98059(20 μmol/L)组；与5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)组比较，##P<0.01

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Increasing inhibition of human hepatic cancer HepG2 cells to 5-fluorouracil by AstragalosideⅡ

Wu Chao1，Xu Dujuan1,2，Yang Cui1，et al

(1College of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032;2Dept of Pharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To investigate the Astragaloside II increasing inhibition of human hepatic cancer (HepG2)cells by 5-fluorouracil and its possible mechanism. Methods The HepG2 inhibiting rate by 5-fluorouracil after alone or jointly acting on cells was detected by MTT method; cells apoptosis was detected by Hoechst33342 staining. The expressions of ERK1/2，p-ERK1/2，PARP,Cleaved PARP,Cleaved caspase 3 and Cleaved caspase 9 proteins were measured by Western blot. Results MTT staining showed that 5-fluorouracil inhibited the proliferation of HepG2 cells and presented dose and time-dependence. Furthermore, combining the Astragaloside II with 5-fluorouracil could further significantly enhance the effect of 5-fluorouracil on cancer cells inhibition (P<0.05). Western blot result proved that combining the Astragaloside II with 5-fluorouracil could increase the expression of Cleaved PARP (P<0.05). Hoechst33342 staining result further validated the level of apoptosis cells was far more increased in the combination group than the 5-fluorouracil group. Moreover, Western blot result also showed that Astragaloside II inhibited the phosphorylation of ERK1/2. Combining the inhibitor of ERK1/2 (PD98059) with 5-fluorouracil may increase apoptosis rate and the expressions of apoptosis related proteins like Cleaved caspase3, Cleaved caspase 9 in HepG2 cells. Astragaloside II showed negative increasing trend of apoptosis rate and the expressions of apoptosis related proteins like Cleaved caspase 3, Cleaved caspase 9 by 5-fluorouracil after blocking ERK1/2 in HepG2 cells. Conclusion Astragaloside II could increase inhibition of human hepatic cancer HepG2 cells by 5-fluorouracil, and the mechanism may be related to inhibiting p-ERK1/2 pathway.

Astragaloside II; 5-fluorouracil ; HepG2 cells; cell apoptosis

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.036.html

安徽省自然科学基金(编号:11040606M222)

1安徽医科大学药学院，合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院药剂科，合肥 230022

武 超，男，硕士研究生；

许杜娟，女，博士，主任药师，责任作者，E-mail:1465102325@qq.com

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0078-05

2015-09-30接收