17—AAG联合卡泊芬净治疗中性粒细胞缺乏大鼠侵袭性肺曲霉菌病的效果

战欣 吴士恒 邓林

[摘要] 目的 探討Hsp90抑制剂17-烯丙基-17脱甲氧基格尔德霉素（17-AAG）联合卡泊芬净（CAS）治疗中性粒细胞缺乏的侵袭性曲霉菌病（IPA）的效果。 方法 将40只Wistar雄性大鼠按随机数字表法分为4组，即A组（空白对照）、B组、C组及D组，每组10只。四组大鼠均用环磷酰胺腹腔注射制备中性粒细胞缺乏模型，再经鼻吸入烟曲霉孢子悬液。A组正常饲养，作为空白对照，B组和C组分别给予1 mg/kg的CAS和1 mg/kg的17-AAG腹腔注射，D组给予17-AAG联合CAS（用法、用量同上），共用药10 d。记录大鼠的生存状况。检测治疗第3天及第7天大鼠的血清半乳糖甘露醇聚糖抗原（GM），并对肺组织进行GMS染色，观察感染部位的真菌负荷。 结果 与A组比较，B组及D组生存率均明显较高（P < 0.01），且D组平均生存时间长于B组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。与A组比较，治疗第3天各组GM值差异无统计学意义（P > 0.05）；治疗第7天，各治疗组GM值低于A组（P < 0.01），D组低于B组（P < 0.05）。肺组织切片GMS染色显示，各治疗组真菌感染病灶均减小，且D组减小最为显著，其治疗第15天未发现病灶。 结论 17-AAG可通过抑制应激反应来提高CAS对大鼠IPA的疗效。

[关键词] 烟曲霉；卡泊芬净；17-烯丙基-17脱甲氧基格尔德霉素；中性粒细胞缺乏

[中图分类号] R519.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（a）-0016-04

Effect of 17-AAG combined with Caspofungin on invasive pulmonary aspergillosis in rats with neutrophil deficiency

ZHAN Xin1 WU Shiheng1 DENG Lin1 ZHANG Hongyue1 GAO Fusheng2▲

1.Clinical Medical School， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261000， China； 2.Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of the combination of Hsp90 inhibitor 17-AAG （17-allyl-17-demethoxygeldanamycin） and Caspofungin （CAS） in the treatmemt of invasive aspergillosis （IPA） with neutrophil deficiency. Methods Forty male Wistar rats were divided into 4 groups， group A， group B， group C and group D， according to random number table method， with 10 rats in each group. Neutrophil deficiency models were made by intraperitoneal injection of Cyclophosphamide in four groups of rats， and then Aspergillus fumigatus spore suspension was inhaled through nose. Group A was fed normally and served as blank control. Group B and C were given CAS of 1 mg/kg and 17-AAG of 1 mg/kg respectively by intraperitoneal injection. Group D was given 17-AAG combined with CAS （the same usage and dosage） for 10 days. The survival status of rats was recorded. The serum galactomannan antigen （GM） was detected on the 3rd and 7th day after treatment， and the lung tissues were stained with GMS to observe the fungal load at the infected sites. Results Compared with group A， the survival rates of group B and group D were significantly increased （P < 0.01）， and the average survival time of group D was longer than that of group B， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with group A， there was no significant difference in GM values between the groups on the third day of treatment （P > 0.05）. On the 7th day of treatment， the GM values of each treatment group were lower than those of group A （P < 0.01）， while group D was lower than group B （P < 0.05）. GMS staining of lung slices showed that the lesions of fungal infection decreased in all treatment groups， and the most significant reduction was found in group D. No lesions were found on the 15th day of treatment. Conclusion 17-AAG improves the efficacy of CAS in the treatment of IPA by inhibiting stress response.

[Key words] Aspergillus fumigatus； Caspofungin； 17-allyl-17 demethoxygeldemycin； Neutrophil deficiency

侵袭性肺曲霉菌病（IPA）是严重的机会性感染性疾病。应用免疫抑制剂以及中性粒细胞缺乏的患者是IPA的高危人群。美国感染病学会推荐伏立康唑作为IPA首选治疗药物。曲霉菌常常对伏立康唑耐药，临床常使用卡泊芬净（CAS）作为补救治疗方法[1-4]。CAS通过抑制真菌细胞壁1，3-β-D-葡聚糖的合成，抑制真菌的生長和分裂[5-6]。Cowen等[7]研究发现真菌可通过应激反应减轻抗真菌药对细胞壁的损伤，推测阻断细胞应激反应信号通路可能会提高抗真菌药物的疗效[8]。Hsp90是一种高度保守的分子伴侣，它能够调节细胞稳态和激活多种客户蛋白并在细胞应激通路中发挥重要的效应，是最常见的调节因子[9]。在无脊椎动物大蜡螟模型中，CAS与Hsp90抑制剂格尔得霉素合用可以使感染烟曲霉的幼虫存活率显著提高[9]。但目前尚不清楚其是否在哺乳动物中也有效。为此，本研究制备了中性粒细胞缺乏IPA大鼠模型并给予CAS联合17-烯丙基-17脱甲氧基格尔德霉素（17-AAG）治疗，探讨抑制Hsp90联合CAS治疗IPA的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠40只，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可号：SCXK（鲁）20140007，合格证号：0000053]，5～6周龄，体重140～180 g，实验前1周饲养于潍坊医学院动物房内，清洁恒温环境，标准饲料喂养，自由取水。

1.2 试药

烟曲霉菌株由潍坊医学院检验科提供。水合氯醛（上海国药集团）、环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司）、卡泊芬净（CAS，上海源叶生物科技有限公司）、17-AAG（medchemexpress公司）、苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、GMS染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、曲霉菌酶免检测试剂盒（合肥莱尔生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 烟曲霉孢子悬液制备 参考文献[10-11]的方法，将烟曲霉菌菌株接种于沙氏琼脂平板培养基上，37℃恒温条件下培养7 d。用含有0.1%吐温80的生理盐水10 mL冲洗培养基表面，收集冲洗液并过滤，将孢子悬液1000 r/min离心10 min，并调整孢子浓度为1×105 cfu/mL。

1.3.2 制备中性粒细胞缺乏侵袭性烟曲霉感染大鼠模型 所有大鼠烟曲霉接种前4 d及接种前1 d腹腔注射环磷酰胺75 mg/kg，接种前1 d及接种后第4天采用血球计数板计数中性粒细胞均<200×106/L，中性粒细胞缺乏IPA大鼠模型制备成功。造模成功后参考Havaux和Denis的方法[12-13]，腹腔注射给予10%的水合氯醛0.3 mL/100 g，麻醉大鼠，每侧鼻孔各缓慢滴入50 μL烟曲霉孢子悬液。

1.3.3 分组 采用随机数字表法将40只Wistar雄性大鼠分为4组，每组各10只：A组（空白对照）正常饲养，B组腹腔注射给予1 mg/kg CAS，C组腹腔注射给予1 mg/kg 17-AAG，D组腹腔注射给予17-AAG + CAS（用法、用量同上），均为1次/d，共治疗10 d。

1.3.4 动物标本处理 接种真菌后第3天及第7天，将大鼠麻醉后固定，经内眦静脉收集血液，3000 r/min离心10 min，留取血清，采用ELISA法测定半乳甘露聚糖抗原（GM），评估其中的真菌负荷，按说明书操作并根据试剂盒提供的标准阈值血清及换算公式计算出被检血清的GM值。GM值=被检样品血清OD值/标准品血清OD值均值，GM<1为阴性，GM>1.5为阳性，1

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用q检验，多组间比较采用单因素方差分析，用log秩检验评估大鼠存活率的差异；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

接受环磷酰胺免疫抑制后第2天，大鼠出现精神状态不佳，饮食及活动减少，毛色灰黄。经鼻接种烟曲霉孢子悬液后，大鼠以上表现加剧，且出现眶周、鼻周带血。治疗7 d后，各组大鼠一般情况略有好转，食欲增加，呼吸平稳，生存时间延长。

2.2 大鼠生存期观察

A组大鼠均在烟曲霉滴鼻后第3天至第8天死亡。与A组比较，C组存活率未提高（P = 0.27），B、D组存活率均在15 d后达到20%（P < 0.01）。其中，D组平均生存时间[（9.80±1.20）d]>B组[（8.8±1.06）d]>C组[（5.6±0.64）d]>A组[（4.7±0.52）d]，中位数平均生存时间D组（8 d）=B组（8 d）>C组（5 d）>A组（4 d）；与B组比较，D组大鼠的存活率没有提高（P = 0.54），但D组大鼠平均生存时间延长。见图1。

2.3 GM试验

接种烟曲霉后第3天，各治疗组血清GM值差异无统计学意义（P > 0.05）。接种后第7天，各组大鼠血清GM值均低于A组（P < 0.01），提示随着治疗时间的延长，对大鼠的治疗效果逐渐明显；与治疗前比较，B、D组其疗效呈时间依赖性的趋势（P < 0.05），其中D组的GM值明显低于B组（P < 0.05），提示联合17-AAG可显著提高CAS的治疗效果。

2.4 肺组织GMS染色

本研究应用GMS染色显示大鼠肺内的烟曲霉菌丝。GMS染色下真菌孢子呈明显的黑褐色。烟曲霉滴鼻后第3、4天，各组均可发现烟曲霉菌丝，但在真菌负荷方面没有明显差异。曲霉滴鼻后第6、7天，各组肺组织发现真菌菌丝明显增多，肺部感染严重。其中，D组菌丝少于其他各组。观察至接种后第15天，仅B、D组有大鼠存活，B组有微量的烟曲霉感染灶，D组未发现烟曲霉感染。见图2。

3 讨论

IPA是一种由曲霉菌引起的疾病，极易危及免疫缺陷患者的生命安全[14-15]。由于IPA發病率和死亡率的增加及抗真菌药物选择的局限性，亟待开发新的IPA治疗方法或药物。近年来，抗癌药物Hsp90抑制剂作为新的抗真菌治疗靶点引起了人们的兴趣[16]。Hsp90为一组进化上高度保守的蛋白，在应激条件下触发适应性反应而发挥作用[17]。抑制真菌分子伴侣Hsp90的功能可以使耐药病原菌对抗真菌药物反应更快，并能阻止其耐药性的产生[8]。CAS通过抑制真菌细胞壁1，3-β-D-葡聚糖的合成而对真菌产生抑菌作用，细胞壁完整性的丧失诱发了真菌的急性应激反应[7]，Hsp90在其中起了关键作用[18-20]。由此推断，抑制Hsp90在应激状态下的功能可以更好地发挥CAS的抗真菌作用。为此，本研究制备了中性粒细胞缺乏IPA模型大鼠，探讨抑制应激反应对CAS治疗大鼠IPA的效果影响。

本研究结果显示，各治疗组经治疗后病情都有缓解，其中联合用药效果最为显著，且与CAS单药治疗比较，其平均生存时间延长。通过测定血清GM值显示，与CAS单药治疗比较，联合用药GM值降低，差异有统计学意义（P < 0.05），提示联合用药治疗更为有效。同时本研究对大鼠肺组织的病理学检测也显示对照组、CAS组、17-AAG组的烟曲霉负荷高于联合用药组，提示了两种药物具有协同作用，抗真菌效果更强。

总之，17-AAG可以通过抑制应激反应提高CAS对大鼠IPA的疗效，提示Hsp90抑制剂与抗真菌药物的联合可能为提高抗真菌治疗效果开辟新的途径，Hsp90可能成为烟曲霉感染治疗的新靶点。

[参考文献]

[1] Chamilos G，Kontoyiannis DP. Update on antifungal drug resistance mechanisms of Aspergillus fumigatus [J]. Drug Resist Updat，2005，8（6）：344-358.

[2] Snelders E，Melchers WJ，Verweij PE. Azole resistance in Aspergillus fumigatus： a new challenge in the management of invasive aspergillosis [J]. Future Microbiol，2011， 6（3）：335-347.

[3] De Pauw B，Walsh TJ，Donnelly JP，et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group （EORTC/MSG） Consensus Group [J]. Clin Infect Dis，2008，46（12）：1813-1821.

[4] Patterson TF，Thompson GR，Denning DW，et al. Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Aspergillosis：2016 Update by the Infectious Diseases Society of America [J]. Clin Infect Dis，2016，63（4）：1-60.

[5] Morrison VA. Echinocandin antifungals：review and update [J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2006，4（2）：325-342.

[6] Maschmeyer G，Glasmacher A. Pharmacological properties and clinical efficacy of a recently licensed systemic antifungal，caspofungin [J]. Mycoses，2005，48（4）：227-234

[7] Cowen LE，Steinbach WJ. Stress，drugs，and evolution：the role of cellular signaling in fungal drug resistance [J]. Eukaryotic Cell，2008，7（5）：747-764.

[8] Cowen LE. The evolution of fungal drug resistance：modulating the trajectory from genotype to phenotype [J]. Nat Rev Microbiol，2008，6（3）：187-198.

[9] Leach MD，Klipp E，Cowen LE，et al. Fungal Hsp90：abiological transistor that tune scelular outputs to thermal inputs [J]. Nat Rev Microbiol，2012，10（10）：693-704.

[10] Mehrad B，Strieter RM，Standiford TJ. Role of TNF-α in pulmonary host defense in murine invasive Aspergillosis [J]. J Immunol，1999，162（3）：1633-1640.

[11] 王妍，龙飞，祁卉卉，等.烟曲霉菌孢子对哮喘大鼠气道炎症和气道反应性的影响[J].中国呼吸与危重监护杂志，2007，6（3）：185-190.

[12] Havaux X，Zeine A，Dits A，et al. A new mouse model of lung allergy induced by the spores of Alternaria alternate and Cladosporium herbarum molds [J]. Clin Exp Immunol，2004，139（2）：179-188.

[13] Denis O，van den Brule S，Heymans J，et al. Chronic intranasal administration of mould spores or extracts to unsensitized mice leads to lung allergic inflammation，hyperreactivity and remodeling [J]. Immunology，2007， 122（2）：268-278.

[14] Kontoyiannis DP，Marr KA，Park BJ，et al. Prospective surveillance for invasive fungal infections in hematopoietic stem cell transplant recipients，2001-2006：overview of the Transplant-Associated Infection Surveillance Network （TRANSNET） Database [J]. Clin Infect Dis，2010， 50（8）：1091-1100.

[15] Pappas PG，Alexander BD，Andes DR，et al. Invasive fungal infections among organ transplant recipients：results of the Transplant Associate Infection Surveillance Network （TRANSNET） [J]. Clin Infect Dis，2010，50（8）：1101-1111.

[16] Trepel J，Mollapour M，Giaccone G，et al. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer [J]. Nat Rev Cancer，2010，10（8）：537-549.

[17] Whitesell L，Lindquist SL. HSP90 and the chaperoning of cancer [J]. Nat Rev Cancer，2005，5（10）：761-772.

[18] Fortwendel JR，Juvvadi PR，Pinchai N，et al. Differential effects of inhibiting chitin and 1，3-{beta}-D-glucan synthesis in ras and calcineurin mutants of Aspergillus fumigatus [J]. Antimicrob Agents Chemother，2009，53（2）：476-482.

[19] Li J，Buchner J. Structure，function and regulation of the hsp90 machinery [J]. Biomed J，2013，36（3）：106-117.

[20] Li J，Soroka J，Buchner J. The Hsp90 chaperone machinery；conformational dynamics and regulation by cochaperones [J]. Acta Biochim Biophys Sin，2012，1823（3）：624-635.

（收稿日期：2018-08-23 本文編辑：王 蕾）