甲状腺细针穿刺细胞学检查与BRAF基因V600E联合检测对甲状腺结节的临床诊断价值

陈生，杨志敏，周滨经，陈均，张启鹤，曲召福

(佛山市南海区第四人民医院，广东 佛山 528211)

甲状腺结节是一种常见的疾病，其检出率达19%～67%，绝大多数甲状腺结节是良性病变，通常无需治疗，仅5%～15%甲状腺结节是恶性肿瘤[1-3]。近年来世界范围内甲状腺癌发病率呈明显上升趋势，术前对甲状腺结节的性质进行定性也变得更重要，诊断甲状腺结节的良恶性、决定治疗方案、监测复发和预测疾病预后，以及基因治疗都有十分重要的意义。本研究探讨超声引导下甲状腺细针穿刺细胞学检查(fine-needle aspiration biopsy，FNAB)与丝/苏氨酸特异性激酶(serine-threonine protein kinase，BRAF)基因V600E联合检测对甲状腺结节的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2018年3月至2019年10月收治甲状腺结节病例，符合术前细针穿刺条件的53例，其中男21例、女32例；患者年龄21～69岁，中位年龄45岁。

1.2 穿刺方法

对患者甲状腺区域局部皮肤消毒后，在彩色超声仪引导下，采用20 mL注射器配9号普通注射针头，经皮刺入甲状腺结节内，保持针管内持续负压10 mL，提插针10～20次，直到所需的标本进入针头柄及针管内，带2 mL负压拔针。

1.3 检验方法

1.3.1试剂准备 试剂盒平衡至室温，充分融解、快速离心10 s；核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据反应体系配制方法计算当次实验所需要的各种试剂量，依次配制600Glu PCR反应混合液和质控PCR反应混合液；按照23 μL/孔分装量将配制好2管PCR反应混合液分装至PCR反应管中；PCR反应管转移至样本准备区。

1.3.2样本准备 提取样本DNA，将待测样本的基因组DNA、弱阳性对照、空白对照，分别加入已分装2种PCR反应混合液的反应管中，即每个待测样本分别用此2种PCR反应混合液进行检测，加入量为2 μL/孔。待测样本的基因组DNA 浓度为5～15 ng/μL；盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。

1.3.3PCR扩增 取样本准备区准备好的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置。设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增。反应结束后，根据扩增曲线，划定合适荧光阈值，得到不同通道Ct值并计算相关△Ct值。

1.3.4结果分析 反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，计算△Ct值(△Ct值=突变检测Ct值-质控检测Ct值)并进行结果判读。

1.4 结果判定

1.4.1细胞病理判断 所有穿刺标本均采用TB-SRTC报告系统，将细胞学结果总体分为6类：(1)标本无法诊断或不满意；(2)良性病变；(3)意义不明确的细胞非典型病变/滤泡性病变；(4)滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤；(5)可疑恶性肿瘤；(5)恶性肿瘤。本实验将(5)、(6)类中组织学诊断为恶性者对应的细胞学标本归为阳性，其余(1)～(4)类组织学诊断为良性者归为细胞学阴性，(5)、(6)归为细胞学阳性。

1.4.2BRAF基因检测判断 若样本的FAM信号有明显的扩增曲线，且Ct值<28时，则样本为阳性，即BRAF基因V600E位点为突变型。反之若样本突变信号无明显扩增，或Ct值≥28时，判定为阴性，即BRAF基因V600E位点为野生型。

1.5 统计学分析

以甲状腺术后病理组织学结果作为判定标准，将所有FNAC评估结果、BRAF基因突变检测结果及两者联合检测结果与之对比。应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，结果运用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由表1～4可见，术前FNAC阳性符合率70.97%，术前BRAF基因突变检测阳性符合率80.65%，FNAC联合BRAF基因突变检测阳性符合率93.55%，FNAC联合BRAF基因突变检测方法在符合率和灵敏度方面要明显优于单独的FNAC或BRAF基因突变检测这两种方法(χ2=6.09，P<0.05)。

表1 术前FNAC与术后病理结果对比

表2 术前BRAF基因突变与术后病理结果对比

表3 FNAC联合BRAF基因突变检测与术后病理结果对比

表4 FNAC、BRAF基因突变检测和联合检测三种方法的比较

3 讨论

目前，临床上鉴别良恶性结节的手段包括超声、细针及粗针活检、甲状腺核素扫描。对于甲状腺结节，FNAB已确定为准确率很高的诊断方法[4]；针对不同诊断结果分别釆用观察、重复或手术等治疗措施，大约10～30%甲状腺结节不能明确性质[4]，包括非典型细胞、滤泡样肿瘤、可疑恶性等3种类型，甲状腺诊断策略对这部分病例建议重复穿刺或手术治疗；诊断的不确定导致这部分患者在临床上处理相对较为盲目[5-7]：选择观察，可能让患者处于对病情过于担心、焦虑和反复就诊的状态，选择激进的诊断性外科手术，可能导致部分良性甲状腺结节患者承担不必要的手术风险及医疗费用支出。因此，术前获得一种准确的诊断手段，就可以避免不必要的手术和二次手术。

近年来，许多研究学者将目光投入基因水平，BRAF是研究最多的癌基因之一，也是甲状腺癌遗传学改变最常见的突变基因。很多研究显示在西方国家对BRAF基因单独或结合其它癌基因的检测明显增加了的检出率。在多数的文献报道中，BRAF突变与肿瘤的发生和肿瘤的分化，以及肿瘤的侵袭性有关，常见于甲状腺癌，是浸润性肿瘤临床表型和预后不佳的指标，其特异性和敏感性均较好，可以作为一个很好的诊断标志物[8-12]。甲状腺结节BRAF基因通过点突变而被激活。最常见的是第1799位单个碱基错义突变(T1799A)导致翻译蛋白质第600位密码子的缬氨酸(Valine)被谷氨酸(Glutamate)替换，成为活化蛋白质激酶(BRAF V600E)。其中甲状腺癌BRAF突变有99%为BRAF V600E突变。乳头状癌遗传学改变中最常见的类型就是BRAF V600E氨基酸置换且40%-45%的肿瘤已被确认会发生BRAF V600E突变[13]。典型的乳头状及高细胞甲状腺癌、1/3的髓样癌和未分化癌中都被证实有BRAF基因突变。去分化型拥有分化型甲状腺癌的特点(如两者都包括BARF基因突变)，这说明分化型可以进展为去分化型。一项多学科的研究表明，BRAF与淋巴结转移，甲状腺外扩散，疾病晚期(III期和IV期)及癌复发密切相关。之前还认为，BRAF基因突变与PTC复发后与放射碘亲和力的缺失密切相关，致使放射性I131治疗抵抗[14-17]。

鉴于BRAF基因突变与PTC的易转移性及癌症复发后放射碘亲和力缺失密切相关，因此手术根治切除突变阳性的癌灶很重要。对于微小乳头状癌(小于或者等于1mm)术式的选择上，美国甲状腺协会推荐应该施行甲状腺腺叶切除，但是如果术前检测BRAF显示阳性，推荐甲状腺全切才安全。另外，大于5 mm的微小型甲状腺乳头状癌也推荐全切，因为大于5 mm比小于5 mm的甲状腺癌复发率将明显提高。

本组病例对甲状腺结节在超声引导下行FNAC，并对样本行BRAF基因检测，将结果和病理结果对比，发现FNAC联合BRAF基因检测的结果符合率和灵敏度高于单独的FNAC或BRAF检测：联合检查的符合率是90.57%，优于FANC的71.70%和BRAF基因检测的79.25%，联合检查的灵敏度是93.94%，优于FANC的77.50%和BRAF基因检测的88.57%，提示联合两种检测方法更优于单独的FNAC或BRAF检测，联合检测能提高术前检查的准确性。

综上所述，甲状腺结节术前FNAC联合BRAF基因检测比单纯的术前FNAC检查具有更高的阳性率和诊断价值，对于FNAC检查中的假阴性或非典型病例，进行BRAF基因检测也可在一定程度上对于鉴别良、恶性甲状腺结节起到辅助作用。更为重要的是BRAF基因检测可以为临床判断患者的预后、治疗方式及分子靶向治疗提供重要的参考依据。