皮肌炎患者外周血单核细胞PD-L1分子的表达及其临床意义①

林嘉鸿 陈国强 张红卫 黎志锋

(佛山市第一人民医院风湿免疫科,佛山528000)

皮肌炎(Dermatomyositis，DM)是一组以肌无力和皮疹为特点的异质性、系统性自身免疫性疾病[1]，其中Gottron征是皮肌炎特异性皮损表现之一，表现为指指关节、掌指关节伸侧的扁平紫红色丘疹。皮肌炎的发病机制复杂且尚未完全明确，但有研究发现皮肌炎病人受累的肌纤维周围有大量的T细胞浸润，部分病人常有多克隆的高球蛋白血症，表明多种免疫细胞如T细胞、B细胞、抗原提呈细胞的异常活化可能参与本病[2]。

共刺激分子是免疫细胞之间信号传导的主要桥梁，其中正性共刺激分子和负性共刺激分子组成了一个错综复杂的信号体系，综合调节免疫反应，在免疫活化和耐受中发挥重要作用。其中PD-L1、PD-L2是程序性死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)的配体，而PD-1/PD-L1/PD-L2是对T细胞活化起负性调控的协同刺激分子信号通路，研究发现，它们在自身免疫性疾病和肿瘤的发病中起重要作用[3,4]。目前关于PD-L1在系统性红斑狼疮[5,6]、干燥综合征[7]等自身免疫性疾病的作用已有多篇报道，但有关PD-L1与皮肌炎间的相关报道甚少。本研究拟通过流式细胞术分析PD-L1在皮肌炎病人外周血单核细胞的表达，并分析其与炎症指标、皮损和肺间质病变等临床特征的相关性。

1 资料与方法

1.1资料 25例皮肌炎患者均来自2015年1月至2018年1月收治于我院风湿免疫科患者，其中男10例，女15例；年龄(56.1±11.2)岁。临床诊断符合皮肌炎诊断标准(Bohan等[8]建议的皮肌炎诊断标准)，并且在纳入研究前半年内均未接受过激素或免疫抑制剂治疗。25例健康对照组的外周血来自2017年12月的按照年龄、性别匹配的健康体检者。

1.2方法 流式细胞术检测PD-L1的表达利用流式细胞术评价外周血单核细胞上PD-L1的表达。采集受试者清晨空腹状态下外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，Ficoll梯度分离外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)经PBS洗涤后配置成1×106细胞悬液，取50 μl分别与3 μl FITC标记CD14抗体(BD公司，美国)以及APC标记的PD-L1抗体(Invitrogen公司，美国)共孵育30 min，PBS洗涤后上机检测。

2 结果

2.1皮肌炎患者外周血单核细胞PD-L1表达水平升高 皮肌炎患者外周血单核细胞中PD-L1表达水平(20.69±1.10)%明显高于健康对照组(10.86±0.79)%，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2PD-L1与炎症指标的关系 红细胞沉降率(Erythrocyte sedimetation rate,ESR)和C反应蛋白(Creatcive protein,CRP)是反映皮肌炎活动的炎症指标。根据ESR、CRP是否升高，将皮肌炎患者分别分为ESR升高组(16例)和ESR正常组(9例)，CRP升高组(17例)和CRP正常组(8例)。分析各组间外周血单核细胞中PD-L1表达差异。ESR升高组外周血单核细胞中PD-L1表达水平(22.64±1.35)%明显高于ESR正常组(17.22±1.30)%，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。CRP升高组外周血单核细胞中PD-L1表达水平(22.99±1.15)%明显高于CRP正常组(15.80±1.26)%，差异有统计学意义(P<0.05,表2)。

GroupsnPD-L1+(%)DM patients2520.69±1.101)Healthy controls2510.86±0.79

Note：1)P<0.05.

2.3PD-L1与典型皮损的关系 根据有无Gottron征，将皮肌炎患者分为Gottron征组(19例)和无Gottron征组(6例)，比较各组间外周血单核细胞中PD-L1表达差异。Gottron征组患者外周血单核细胞中PD-L1表达水平(22.15±1.26)%明显高于无Gottron征组(16.07±0.82)%，差异有统计学意义(P<0.05,图1)。

2.4PD-L1与肺间质病变的关系 根据有无肺间质病变(符合下列诊断标准中1项及1项以上，且发病时病原学检查排除肺部感染：①肺功能异常，具体表现为限制性通气功能障碍，弥散功能降低，CO弥散率<80%时具有诊断意义；②不明原因的静息或活动后气促；③不明原因咳嗽>3个月；④肺部听诊闻及Velcro啰音；⑤肺高分辨率CT有肺间质病变的影像学改变)，将皮肌炎患者分为伴肺间质病变组(6例)和无肺间质病变组(19例)，比较两组间外周血单核细胞中PD-L1表达差异，伴肺间质病变组外周血单核细胞中PD-L1表达水平(26.88±2.05)%明显高于无肺间质病变组(18.74±0.94)%，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

Inflammatory markersnPD-L1+(%)ESR High1622.64±1.351) Normal917.22±1.3CRP High1722.99±1.151) Normal815.80±1.26

Note：1)P<0.05.

图1 有和无Gottron征皮肌炎患者外周血CD14+单核细胞PD-L1表达水平的比较Fig.1 Comparison of PD-L1 expression levels on CD14+ mononuclear cells of DM patients with or without Gottron′s signNote: *.P<0.05.

图2 有和无肺间质病变皮肌炎患者外周血CD14+单核细胞PD-L1表达水平的比较Fig.2 Comparison of PD-L1 expression levels on CD14+ mononuclear cells of DM patients with or without interstitial lung diseaseNote：*.P<0.05.

3 讨论

皮肌炎是一种以横纹肌炎性细胞浸润为特点的自身免疫性疾病，可累计肺脏等多种重要脏器，致死率高，该病的具体发病机制尚未完全明确，目前知道T细胞介导的细胞免疫可能参与该病。T细胞活化需要双重信号，除MHC-抗原肽-TCR相互结合产生第一信号外,还需要T细胞表面受体与APC表面的相应配体等共刺激分子结合产生第二信号，这些共刺激分子在免疫应答中起着至关重要的作用，介导和参与肿瘤、感染及自身免疫性疾病等[9-12]。目前已有多种协同刺激信号通路被发现及研究，其中PD-1/PD-L1信号通路是一种负性协同刺激信号通路，可以传导抑制性的信号而调节T细胞的活化和耐受，从而介导和/或破坏免疫平衡(自身耐受性)，参与系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等多种自身免疫性疾病及肿瘤性疾病[13-15]。其中SLE患者外周血PBMC中存在PD-1及PD-L1表达异常，导致机体免疫耐受失调而产生自身抗体[16]。干燥综合征患者唾液腺淋巴细胞PD-1表达上调，腺泡和导管上皮细胞上的PD-L1也存在表达上调[7]。

但截至目前为止尚无PD-L1与皮肌炎的相关报道，本研究提示PD-L1在皮肌炎的单核细胞表面异常表达，并可能与肌炎、皮损和肺间质病变等疾病活动相关。

作为负性调控信号，PD-L1/PD-1主要抑制T细胞活化和增殖。病原菌通过PD-L1/PD-1信号通路抑制宿主免疫防御，而使病原菌感染持续。肿瘤组织通过PD-L1/PD-1信号通路抑制特异性T细胞免疫，从而避免被T细胞杀伤[17]。但在本研究中，皮肌炎患者单核细胞的PD-L1表达水平明显高于健康对照组，且皮肌炎患者单核细胞PD-L1表达水平与炎症指标、肌炎、皮损、肺间质病变呈正相关，提示单核细胞PD-L1表达水平越高，病情活动度越高。这一结果与感染和肿瘤中PD-L1抑制T细胞的活性作用明显不同。因此，我们猜测皮肌炎患者中单核细胞表达的PD-L1可能向T细胞提供正向调控信号，从而参与及加重皮肌炎病情。

总之，皮肌炎患者外周血单核细胞的PD-L1分子表达水平存在异常，并且与疾病活动相关，但其具体作用机制仍需进一步研究。若条件允许，后期我们将进一步扩大样本量来验证实验结果,此工作可能为进一步探讨PD-L1分子的生物学功能及皮肌炎的发病机制提供线索。