GANT61阻断Hedgehog信号通道调控肺腺癌A549/DDP细胞耐药的机制研究①

郑 涛 李 华 张 黎 张献全

(重庆医科大学附属第二医院肿瘤科，重庆400010)

肺癌是死亡率最高的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌占肺癌总数的85%，由于早期症状不典型，大部分患者确诊时已是ⅢB期或IV期。近年来分子靶向治疗明显地提高了非小细胞肺癌患者的生存时间，但仍有超过40%患者因未找到合适的靶点，故以铂类为基础的化疗依然是标准一线治疗方案[2]。由于肿瘤细胞对顺铂存在原发性或后天获得性耐药，缩短了患者的总生存期[3]。肿瘤细胞耐药性受多条信号传导途径调控，其中包括Hedgehog(Hh)信号通路[4]。该通路在包括肺癌在内的多种肿瘤中激活[5]。经典的Hedgehog信号通路传导途径可简单归纳为：Hh-Ptch-Smo-Gli(Gli1、Gli2、Gli3)，其中Gli1的表达量通常被认为是Hh信号传导活性的量度[6]。GANT61是转录因子Gli1有效的抑制剂[7]。已有研究证明GANT61有明确的抗肿瘤作用，如胃癌[8]、口腔癌[9]。Gli1的过表达与肿瘤化疗耐药密切相关，GANT61能特异性阻滞Gli1从而改善恶性肿瘤细胞的化疗敏感性[10-12]。近年来研究表明Hedgehog信号通路的激活与进展期非小细胞肺癌中铂类化疗耐药可能相关[13],因此通过抑制该信号通路为逆转非小细胞肺癌对顺铂耐药带来了可能。

目前有关GANT61对耐药肺癌细胞的影响及机制研究甚少。本研究以人肺腺癌细胞A549/DDP为研究对象，观察GANT61对A549/DDP的抑制效应、GANT61与顺铂的联合使用的协同效应，并通过检测与细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤修复相关蛋白来探讨其分子机制，为肺腺癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 人肺腺癌A549细胞株由重庆医科大学生命科学院惠赠。人肺腺癌A549/DDP细胞株购自国家实验细胞资源共享平台。

1.1.2药品与试剂 RPMI1640培养基、双抗(青-链霉素)购自Gibco公司，胎牛血清购自以色列BI公司，兔抗人Gli1单克隆抗体购自Cell Signaling公司，兔抗人Shh、Ptch1、XRCC1、cyclinD1、cleaved caspase-3、c-myc单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人β-actin多克隆抗体购自Proteintech公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(二抗)购自江苏碧云天公司，GANT61、顺铂购自Sigma公司，CCK8细胞毒性试剂盒购自DOJINDO公司。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养 两种细胞株均在37℃、5%CO2条件下孵育，采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基培养。A549/DDP细胞在每次传代贴壁后用2 μg/ml的顺铂维持耐药性。当细胞融合度达80%～90%时消化传代，常规传代的时间为每2～3 d。实验前1周停止顺铂刺激A549/DDP细胞。选用对数生长期细胞进行实验。

1.2.2CCK8法检测细胞增殖活性 取对数期生长的A549及A549/DDP细胞株制成细胞悬液，用完全培养基调整细胞浓度为5×105个/ml，96孔板每孔接种量为100 μl，继续培养24 h待细胞完全贴壁后分别加入1、2、4、8、16、32 μg/ml的顺铂溶液处理A549、A549/DDP细胞48 h，检测顺铂不同浓度下A549、A549/DDP细胞的抑制率，使用GraphPad Prism 5计算两株细胞IC50，得到A549/DDP耐药指数(RI)=A549/DDP细胞IC50/A549细胞IC50。按照上述方法，以2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的GANT61处理A549/DDP细胞，种板密度为5×105个/ml、3.5×105个/ml时分别处理24 h、72 h，测定不同浓度GANT61对A549/DDP细胞的抑制率。同理，取A549/DDP细胞以3.5×105个/ml接种于96孔板，待细胞贴壁后以20 μmol/L的GANT61预处理细胞24 h，然后给予20 μmol/L的GANT61和4种浓度梯度(1、2、4、8 μg/ml)的顺铂溶液联合处理细胞48 h后检测联合用药抑制率。以上试验均设置不含药物(但GANT61组需加0.1%DMSO)、含细胞的对照组和只含培养基的调零组，每组均给予5个复孔。实验终止前，弃去含药培养基，加入含10% CCK8溶液的无血清培养基100 μl，30 min后置于酶标自动分析仪，在450 nm波长测定光吸收值[A]。按以下公式计算各组存活率：存活率=[(实验组A-调零孔A)/(对照组A-调零孔A)]×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的A549/DDP细胞传代贴壁后，分别加入含30、60 μmol/L 的GANT61完全培养基，阴性对照组培养基中加入0.1% DMSO。培养24 h后PBS洗涤2次、胰酶消化、收集细胞，加入75%乙醇1 ml吹打成细胞悬液，300目滤网过滤，4℃固定24 h后用流式细胞术检测细胞周期。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的A549/DDP细胞传代贴壁后，分别加入含30、60 μmol/L的GANT61完全培养基处理24 h，阴性对照组培养基中加入0.1%DMSO。PBS洗涤2次、胰酶消化、离心细胞，加入1 ml的PBS吹打成细胞悬液，300目滤网过滤，用Annexin V/PI双染色法在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.2.5Western blot检测 将细胞分为3大组：第1大组为正常培养的A549、A549/DDP细胞；第2大组为分别给予30、60 μmol/L的GANT61处理24 h的A549/DDP细胞，0.1%DMSO处理作为阴性对照；第3大组包括顺铂单药组(4 μg/ml处理48 h)、GANT61单药组(20 μmol/L处理72 h)、GANT61联合顺铂组(20 μmol/L GANT61预处理24 h，再给予20 μmol/L GANT61和4 μg/ml顺铂联合处理48 h)、阴性对照组(0.1%DMSO处理72 h)。将上述处理的细胞加入适量裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1) 提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST洗膜3次后加入一抗，分别以稀释过的Gli1抗体(1∶1 000)、Ptch1抗体(1∶1 000)、Shh抗体(1∶2 000)、cyclinD1抗体(1∶5 000)、c-myc抗体(1∶10 000)、cleaved caspase-3抗体(1∶500)、XRCC1抗体(1∶2 000)及β-actin抗体(1∶2 000) 4℃孵育过夜，次日将膜用TBST漂洗3次，再以HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST再次漂洗3次，最后用ECL法显影，image-lab软件行灰度分析。

1.2.6协同作用的评估 根据下列公式评价体外联合用药作用：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb) Ea+b表示联合用药抑制率，Ea、Eb分别表示a、b单药的抑制率。明显拮抗(--)时Q值<0.55，拮抗(-)时Q值为0.55～0.85，单纯相加(+)时Q值为0.86～1.15，增强(++)时Q值为1.16～2.00。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，LSD-t检验评价多组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1A549/DDP细胞的耐药指数(RI) CCK8结果表明：相同顺铂浓度下A549/DDP细胞的存活率明显高于A549细胞(图1A)。A549细胞IC50为(1.55±0.35)μg/ml，A549/DDP细胞IC50为(8.28±1.00)μg/ml，其耐药指数约为5.34(t=11.03，P<0.01)(图1B)，证实A549/DDP细胞对顺铂的耐药性，可用于后续实验。

2.2Hedgehog信号通路在A549/DDP细胞中激活 Western blot从蛋白水平检测两种细胞中Hedgehog信号通路相关蛋白Ptch1、Gli1、Shh的表达(图2A)。相比于A549细胞，A549/DDP细胞中Ptch1、Gli1、Shh在蛋白水平的表达均明显增高(t=4.09，P<0.05；t=5.93，P<0.01；t=8.98，P<0.01)(图2B)。

2.3XRCC1蛋白在A549、A549/DDP细胞中的表达差异 Western blot从蛋白水平检测两种细胞中XRCC1的表达(图3A)。相比于A549细胞，A549/DDP细胞中XRCC1在蛋白水平的表达明显增高，差异有统计学意义(t=13.30，P<0.01)(图3B)。结果说明XRCC1高表达可能与A549/DDP细胞耐药相关。

2.4GANT61对A549/DDP细胞生长的影响 图4A表明：A549/DDP细胞经不同浓度GANT61作用24 h后，浓度≥20 μmol/L时A549/DDP细胞活力降低，且随着浓度增大，细胞抑制作用明显，呈浓度依赖性(F=145.62，P<0.01)。GANT61处理A549/DDP细胞24 h的IC50为(49.03±5.75) μmol/L。因此在后续试验中我们选用IC50左右的浓度(30、60 μmol/L)处理细胞，用于检测其对细胞周期和凋亡的影响。图4B表明：A549/DDP细胞经不同浓度GANT61作用72 h后，浓度为2.5 μmol/L时A549/DDP细胞活力增加(t=3.59，P<0.01)；5 μmol/L时细胞活力无明显变化(P>0.05)；≥10 μmol/L时A549/DDP细胞活力降低，且随着浓度增大，细胞抑制作用越明显，呈浓度依赖性(F=376.66，P<0.01)。GANT61处理A549/DDP细胞72 h的IC50为(22.74±2.03) μmol/L。20 μmol/L GANT61对A549/DDP细胞的抑制率为(40.3±6.11)%，因此，我们选用20 μmol/L GANT61联合顺铂培养细胞72 h 为条件，用于后续实验。

图1 顺铂对A549及A549/DDP细胞的存活率和IC50的影响Fig.1 Effect of Cisplatin on survival rate and DDP IC50 for A549 cells and A549/DDP cellsNote：**.P<0.01，vs the control (A549 cells)；n=3.

2.5GANT61对A549/DDP细胞凋亡率的影响 随着GANT61浓度的增加，A549/DDP细胞凋亡逐渐增加(F=19.36，P<0.01)(图5A)。30、60 μmol/L GANT61作用于A549/DDP细胞24 h后，凋亡率分别为(10.26±2.53)%和(16.29±2.83)%，与对照组凋亡率(4.89±0.84)%相比，差异有统计学意义(t=2.93，P<0.05；t=6.22，P<30和60 μmol/L GANT61处理组的G1期细胞数明显高于对照组(t=5.72，P<0.01；t=9.51，P<0.01)，而S期细胞数明显少于对照组(t=2.46，P<0.05；t=5.37，P<0.01)(图6B)。结果说明，GANT61作用可使A549/DDP细胞阻滞在G1期。

图2 Western blot检测Ptch1、Gli1、Shh蛋白在A549、A549/DDP细胞中的表达Fig.2 Expression level of Ptch1，Gli1 and Shh protein in A549 and A549/DDP cells were detected by Western blotNote：*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (A549 cells)；n=3.

图3 Western blot 检测XRCC1蛋白在A549、A549/DDP细胞中的表达Fig.3 Expression level of XRCC1 protein in A549 and A549/DDP cells were detected by Western blotNote：*.P<0.01，vs the control (A549 cells)；n=3.

0.01)(图5B)。

2.6GANT61对A549/DDP细胞周期的影响 流式细胞仪检测细胞周期表明(图6A)：随着GANT61浓度的增加，G1期细胞逐渐增加(F=45.80，P<0.01)，S期细胞逐渐减少(F=14.45，P<0.01)。各时期的细胞比例如下：空白对照组:G1期(64.17±5.38)%、S期(23.67±6.75)%、G2期(8.67±2.13)%；30 μmol/L GANT61组:G1期(81.74±3.37)%、S期(14.14±4.26)%、G2期(4.11±1.90)%；60 μmol/L GANT61组:G1期(93.4±1.50)%、S期(2.87±1.96)%、G2期(3.97±1.22)%。

图4 CCK8检测不同浓度的GANT61处理对A549/DDP细胞活力的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of GANT61 on viability of A549/DDP cells was detected by CCK8Note：A.24 h；B.72 h.**.P<0.01，vs 0 μmol/L GANT61(as the control )；n=3.

图5 不同浓度的GANT61处理24 h对A549/DDP细胞凋亡率的影响Fig.5 Effect of different concentrations of GANT61 treatment for 24 h on the apoptotic rate of A549/DDP cells was detected with Annexin V-FITC/propidium iodide staining and flow cytometryNote：*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

2.7GANT61对A549/DDP细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响 A549/DDP细胞经不同浓度GANT61作用24 h后，结果(图7A～C)显示：各组细胞中Gli1、c-myc、cyclinD1、cleaved caspase-3随着GANT61浓度的增高表达水平有显著差异(F值分别为51.29、24.45、44.89、26.70，P值均<0.01)；其中，30、60 μmol/L GANT61处理组的Gli1、c-myc、cyclinD1表达量均较对照组明显降低(t值分别为6.51、9.97、3.91、6.98、5.91、9.37，P值均<0.01)，cleaved caspase-3表达量较对照组明显升高(t=2.46，P<0.01；t=7.19，P<0.01)。

2.8GANT61联合顺铂对A549/DDP细胞体外增殖的影响 培养至72 h时，20 μmol/L GANT61与小于IC50浓度的顺铂(1、2、4、8 μg/ml)联合用药对A549/DDP细胞的增殖抑制率均呈增强作用(见表1、2)。

2.9GANT61与顺铂联合用药对A549/DDP细胞中XRCC1蛋白表达的影响 20 μmol/L GANT61、20 μmol/L GANT61与4 μg/ml顺铂联合用药均能使XRCC1表达量显著下降(图8A)，差异有统计学意义(t=5.10，P<0.01；t=10.20，P<0.01)(图8B)。

图6 不同浓度的GANT61处理24 h对A549/DDP细胞周期的阻滞作用Fig.6 Blocking effect of different concentrations of GANT61 for 24 h on cell cycle of A549 /DDP cells was detected by flow cytometryNote：*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

图7 Western blot检测30 μmol/L、60 μmol/L的GANT61对A549/DDP细胞Gli1、c-myc、cyclinD1、cleaved caspase-3表达影响Fig.7 Expression levels of Gli1,c-myc,cyclinD1,cleaved caspase-3 proteins in A549/DDP cells treated with 30 μmol/L and 60 μmol/L GANT61 for 24 h were detected by Western blotNote：1.DMSO control；2.30 μmol/L GANT61；3.60 μmol/L GANT61.*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

Tab.1 Proliferation inhibition rate of A549/DDP cells between cisplatin groups,GANT61 group and combination groups

GroupsConcentration Inhibition rate(%)Cisplatin group1 μg/ml1.97±4.842 μg/ml9.73±2.294 μg/ml25.7±4.558 μg/ml45.3±5.86GANT61 group20 μmol/L39.9±6.81Cisplatin + GANT61 group1 μg/ml+20 μmol/L54.23±9.142 μg/ml+20 μmol/L65.33±7.174 μg/ml+20 μmol/L69.27±7.558 μg/ml+20 μmol/L78.83±7.72

表2 顺铂联合GANT61对A549/DDP细胞协同抗肿瘤作用

Tab.2 Synergistic anti-tumor effect of simultaneous administration of cisplatin and GANT61 on A549/DDP cells

Cisplatin + GANT61Q1 μg/ml+20 μmol/L1.322 μg/ml+20 μmol/L1.434 μg/ml+20 μmol/L1.258 μg/ml+20 μmol/L1.17

图8 Western blot检测DDP和GANT61单药及联合用药后A549/DDP细胞中XRCC1蛋白的表达情况Fig.8 Expressions of XRCC1 protein in A549/DDP cells treated with DDP and GANT61 alone and in combination were detected by Western blotNote：**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

3 讨论

本研究显示，耐顺铂的人肺腺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药指数为5.34，为中度耐药细胞。达丽隽等[14]研究发现抑制A549/DDP细胞中Gli1的表达能逆转顺铂对细胞的耐药。本实验也证实A549/DDP细胞中Hedgehog信号通路激活，Western blot结果显示其相关蛋白Ptch1、Gli1、Shh表达水平均明显上调。同时，我们发现A549/DDP细胞中XRCC1在蛋白水平的表达较A549细胞明显增高，因此我们推测Hedgehog信号通路的激活可能通过上调XRCC1蛋白的表达而参与顺铂耐药。

Hedgehog信号通路激活后，Hh配体与其受体Ptch结合后解除对Smo的抑制，并将该信号转导到下游转录因子Gli1、Gli2和Gli3，调节细胞周期、生存、迁移和代谢[15]。非经典的Hh信号通路也调控Hh/Gli信号，多种途径(如AKT、MAPK、RAS、EGFR)可以激活肿瘤细胞中的Gli因子[16]。GANT61与细胞核中的Gli1 DNA结合降低Gli1的转录活性，抑制Hedgehog通路下游关键组份的活性，无论Hh信号激活的模式如何[17]。因此，抑制Hh通路下游的Gli1将会取得更大效果，故本试验选择GANT61作为Hh信号通路的阻滞剂来研究其对A549/DDP细胞的生物学行为。

本研究通过CCK8检测表明，GANT61处理A549/DDP细胞24 h，其浓度≥20 μmol/L时明显抑制细胞增殖，且呈现剂量依赖性。GANT61处理A549/DDP细胞72 h，其浓度≥10 μmol/L也出现相同的效应。流式细胞术结果显示经GANT61处理24 h后，A549/DDP细胞凋亡率随药物浓度增加而升高。细胞周期检测表明，随着GANT61浓度的增高，G1期细胞比例也逐渐增高，而S期细胞比例逐渐下降，导致癌细胞阻滞在G1期。通过细胞周期和凋亡的检测，说明GANT61通过阻滞细胞周期和促进细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖。这些结果均显示出GNAT61治疗肺癌的广阔前景。

c-myc是与肿瘤发生发展有关的重要原癌基因，其通过调节细胞从G1期到S期的转换促进细胞的增殖[18]。cyclinD1是细胞周期蛋白家族中调控G1/S转换的关键蛋白，该蛋白在肿瘤增殖中起重要作用。Hh/Gli信号传导激活导致下游靶基因c-myc、cyclinD1表达增加，调节细胞增殖和细胞周期[19]。研究表明，GANT61下调神经母细胞瘤细胞的Gli1、c-myc和cyclinD1表达，使细胞周期阻滞在G1期，诱导神经母细胞瘤细胞凋亡[20]。本研究结果表明，GANT61处理A549/DDP细胞后，Gli1蛋白显著下降，导致其下游靶标c-myc、cyclinD1蛋白表达显著降低，从而引起细胞周期阻滞于G1期。caspase-3是执行凋亡过程的关键蛋白分子，其被活化剪切形成cleaved caspase-3发挥诱导凋亡作用。Gli也涉及线粒体凋亡信号通路，凋亡基因caspase-3被鉴定为Gli的直接转录靶基因[21]。本研究显示，GANT61处理A549/DDP细胞后，cleaved caspase-3表达增高，说明GANT61可能通过线粒体凋亡途径导致A549/DDP细胞凋亡。

顺铂与细胞内DNA发生交联，形成顺铂-DNA加合物，引发一系列细胞内事件，最终导致细胞死亡。碱基切除修复(BER)、单链断裂修复(SSBR)、核苷酸切除修复(NER)途径参与铂诱导的DNA损伤；X射线修复交叉互补基因1(XRCC1)蛋白是BER和SSBR途径的关键组份，其对于NER也是必需的[22]。Zhang等[23]研究发现通过shRNA下调XRCC1蛋白，抑制了DNA修复能力，增加顺铂对人肝癌细胞HepG2的毒性，提高了顺铂的敏感性。Kudo等[24]研究发现，用抗Gli1 shRNA预处理耐顺铂的人卵巢癌细胞系A2780-CP70明显增加顺铂对细胞的杀伤力，将顺铂IC50从30 mmol/L降低至5 mmol/L，与抑制顺铂诱导的XRCC1基因的上调有关。本实验CCK8检测表明，顺铂与GANT61联合应用增强顺铂对A549/DDP细胞的杀伤作用，具有体外协同抗增殖作用。GANT61单药组、GANT61和顺铂联合用药组均能显著下调A549/DDP细胞中XRCC1蛋白的表达，表明XRCC1可能为Hedgehog信号通路的下游靶标；GANT61与顺铂体外协同抗增殖作用的机制与减少A549/DDP细胞XRCC1蛋白的表达有关。

总之，GANT61能够通过下调细胞周期相关蛋白c-myc和cyclinD1的表达来阻滞细胞周期进程，激活caspase-3诱导细胞凋亡，从而抑制人肺腺癌耐药细胞A549/DDP的增殖。GANT61与顺铂存在体外协同抗增殖作用，其机制可能与减少耐药细胞株A549/DDP中XRCC1蛋白的表达有关。肿瘤细胞的增殖和耐药与多种基因、多种途径有关，故仍需进一步研究其他机制。