超高分辨率小动物超声影像系统在大鼠腹主动脉移植模型中的应用

徐泽勤,李立强,谷涌泉,李建新,冯增国,佟 铸,许 晴,高喜翔,齐一侠,郭建明,张 建*

(1.首都医科大学宣武医院血管外科 首都医科大学血管外科研究所，北京 100053；2.北京理工大学材料科学与工程学院，北京 100081；3.首都医科大学医学实验与检测中心，北京 100069)

当前心血管疾病是造成死亡的首要原因[1]。对终末期心血管疾病患者常需进行血管重建，以自体血管移植效果较好，然而目前临床血管重建所需自体血管存在供源有限和尺寸不匹配等缺陷[2]，人工降解血管材料因此受到广泛关注，但此类材料存在力学性能及生物相容性差等缺点。近年来，国内外学者[3-4]致力于构建组织工程血管的材料学研究,寻找可代替自体血管用于临床的血管移植物。

血管移植相关动物实验中，常需对移植物进行血流动力学检查，超声技术是目前应用最广泛的成像方法。但临床超声检查的成像频率常为12～15 MHz，图像空间分辨力为300 μm，不足以精确测量小动物移植血管血流动力学相关数据。过去十余年中，高频率成像系统获得长足发展，超声检查对小动物模型结构成像的空间分辨力进一步提高，并已用于心血管研究领域[5]。本课题组[6]既往研究发现，肝素表面改性后的聚ε-己内酯[Poly(ε-caprolactone), PCL]材料具有良好的生物相容性。本研究应用超高分辨率小动物超声影像系统检测PCL-肝素人工血管在大鼠体内血流动力学变化，探讨其在大鼠腹主动脉移植模型中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 大鼠腹主动脉移植模型建立 选取雄性Wistar大鼠10只(购于北京维通利华实验动物技术有限公司，北京市实验动物质量合格许可证编号为SCXK:2016-0006)，8～9周龄，体质量300～320 g，中位体质量310.8 g。将大鼠放入麻醉诱导箱，调节氧气至1 L/min，调节恩氟烷至2.5%。全身麻醉大鼠后，将其以俯卧位保定于大鼠专用操作台，口鼻部置于麻醉面罩内，调节恩氟烷的维持量为2%～3%。备皮、消毒后，沿腹部正中依次切开皮肤、肌肉直至暴露腹腔。分离腹主动脉前脂肪组织，分离肾下腹主动脉。阻断腹主动脉后切开血管，采用直径2 mm、长10 mm的PCL-肝素人工血管(由北京理工大学提供)端端吻合于腹主动脉(图1A),充分止血后逐层关闭腹腔。

1.2 血流动力学检查 采用VisualSonics Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统，MS 550D探头(中心频率40 MHz)，焦距7 mm，轴向分辨力和横向分辨力分别为40 μm和90 μm；分别于建模后1、2、3个月行血流动力学检查，观察腹主动脉移植物通畅情况。检查前对大鼠以恩氟烷进行麻醉，方法同前。分别检测大鼠腹主动脉近心端吻合口处正常血管、PCL-肝素人工血管及远心端吻合口处正常血管的血流动力学变化，检测指标包括血管内径、管壁厚度及血流速度。

1.3 离体标本观察 完成末次血流动力学检查后麻醉大鼠，方法同前。局部消毒后切开皮肤、肌肉直至暴露腹腔。游离PCL-肝素人工血管周围组织，主要是下腔静脉、血管周围纤维结缔组织。以动脉夹分别夹闭PCL-肝素人工血管近心端及远心端，剪断动脉夹间血管，取出PCL-肝素人工血管，以生理盐水充分冲洗管腔后，沿血管纵行切开，观察离体血管形态。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件。计量资料以±s表示，各部位不同时间点间血管内径、管壁厚度、血流速度比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法；瘤样扩张与未扩张的PCL-肝素人工血管间血管内径、管壁厚度、血流速度比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管形态改变 建模后1个月，血流动力学检查未发现PCL-肝素人工血管呈动脉瘤样扩张改变(图2A)；2个月3只大鼠体内移植物出现动脉瘤样扩张(图2B)；3个月5只大鼠体内移植物出现动脉瘤样扩张(图2C)。

末次血流动力学检测完成后取材，离体标本观察证实超声所见5只大鼠体内PCL-肝素人工血管出现动脉瘤样扩张(图1C)，血管内壁苍白，内膜下可见脂质沉积(图1E)；其余5只大鼠体内PCL-肝素人工血管形态均规则(图1B)，血管内壁光滑(图1D)。

2.2 血流动力学指标变化

2.2.1 管壁厚度和血管内径 建模后1、2、3个月，近心端吻合口处正常血管、远心端吻合口处正常血管管壁厚度差异均无统计学意义(P均>0.05)，而PCL-肝素人工血管管壁厚度差异有统计学意义(P<0.01)；两两比较，移植模型建立后1个月与2个月(P=0.01)、1个月与3个月(P<0.01)管壁厚度差异均有统计学意义，而2个月与3个月(P=0.06)差异无统计学意义。见表1。

建模后1、2、3个月近心端吻合口处正常血管、远心端吻合口处正常血管及PCL-肝素人工血管内径差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

建模后2个月与3个月瘤样扩张与未扩张的PCL-肝素人工血管管壁厚度差异无统计学意义(t=1.44、0.07，P=0.20、0.95)；建模后2个月瘤样扩张与未扩张的PCL-肝素人工血管内径差异无统计学意义(t=2.35，P=0.06)，而建模后3个月瘤样扩张的PCL-肝素人工血管内径明显大于未扩张者(t=2.94，P=0.03)。见表2。

2.2.2 血流速度 动脉瘤样扩张PCL-肝素人工血管腔内血流速度明显下降，声像图表现为颜色不一的紊乱血流信号(图2B)，未扩张PCL-肝素人工血管腔内血流呈正常波峰形态(图2A)。建模后1、2、3个月，近心端吻合口处正常血管、远心端吻合口处正常血管及PCL-肝素人工血管血流速度差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 大鼠腹主动脉移植模型正常血管不同时间血流动力学检查指标(±s,n=10)

表1 大鼠腹主动脉移植模型正常血管不同时间血流动力学检查指标(±s,n=10)

检测时间近心端吻合口处正常血管血管内径(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)PCL-肝素人工血管血管内径(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)远心端吻合口处正常血管血管内径(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)建模后1个月1.92±0.070.36±0.04808.55±134.481.85±0.120.45±0.06505.76±41.921.87±0.040.31±0.03609.55±62.85建模后2个月1.98±0.120.32±0.05796.23±65.831.83±0.050.63±0.08500.04±80.151.85±0.080.29±0.04635.61±71.43建模后3个月1.94±0.050.33±0.06825.89±109.771.82±0.100.74±0.05560.81±96.341.77±0.150.30±0.03653.72±100.68F值0.400.650.060.0816.920.580.780.140.23P值0.690.550.090.99<0.010.59 0.500.880.80

图1 PCL-肝素血管移植及取出 A.将PCL-肝素人工血管植入大鼠腹主动脉，建立大鼠腹主动脉移植模型； B.移植模型建立后3个月取材，正常PCL-肝素人工血管形态； C.移植模型建立后3个月取材，动脉瘤样扩张PCL-肝素人工血管形态； D.移植模型建立后3个月取材，正常PCL-肝素人工血管内腔表面； E.移植模型建立后3个月取材，动脉瘤样扩张PCL-肝素人工血管内腔表面

检测时间瘤样扩张(n=5)血管内径(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)未扩张(n=5)血管内径(mm)管壁厚度(mm)血流速度(mm/s)建模后1个月———1.85±0.120.45±0.06505.76±41.92建模后2个月2.19±0.310.70±0.05353.85±144.501.83±0.050.63±0.08500.04±80.15建模后3个月2.80±0.660.75±0.28218.30±126.381.82±0.100.74±0.05560.81±96.34

图2 大鼠腹主动脉移植模型建立后超高分辨率小动物超声影像系统血流动力学检查 A.建模后1个月PCL-肝素人工血管声像图，血管未扩张； B.建模后2个月PCL-肝素人工血管声像图，血管呈瘤样扩张； C.建模后3个月PCL-肝素人工血管声像图，血管呈瘤样扩张

建模后2个月瘤样扩张与未扩张的PCL-肝素人工血管血流速度差异无统计学意义(t=1.82，P=0.12)，但建模后3个月瘤样扩张的PCL-肝素人工血管血流速度明显低于未扩张者(t=4.28，P=0.01)。见表2。

3 讨论

生物可降解材料组织工程血管是当前研究热点之一。聚己内酯因其强度高、降解速率、孔径人工可调、易加工及在体内降解产物对人体无害等优点而广泛应用于血管组织工程相关领域[7]。肝素含有糖胺聚糖成分，可促进组织生长[6]。与其他细胞外基质相比，多糖可为生物材料提供结合活性物质的位点，同时稳定性更高而免疫原性更低[8]。应用静电纺丝技术制备纳米纤维，可模拟天然细胞外基质的结构，有助于细胞生长[9]；通过肝素表面改性后，以这种技术制备的PCL材料血管具有较好的生物学性能[6]。

MRA、CTA等影像学检查是诊断动脉病变的重要依据。MRA通过非对比增强和对比增强技术使血管显像，可评估动脉管腔[10]。近年来迅速发展的三维时间飞跃法MR血管成像(3D time-of-flight MR angiography, 3D TOF MRA)技术无需注射对比剂，不存在电离辐射，适用于需长期影像学观察的患者；但MRA检查费用较为昂贵，扫描时间较长。CTA也可用于评估动脉病变，与MRA相比,主要优势在于图像采集相对较快，通常可在1 min内完成对主动脉的图像采集，其主要缺点是存在电离辐射，同时CTA过程中需要使用碘对比剂[10]。超声血管检查无需造影剂，不存在电离辐射，且可准确检测血管及移植物的血流动力学变化[4]；超声造影以声诺维(SonoVue)作为血池显像剂，通过谐波成像技术，可准确监测各种脏器的血液微循环灌注情况。SonoVue不经过肾脏代谢，无肾脏毒性，能够随呼吸排出体外，动物实验[4]及临床研究[11-12]均已证实其安全性。目前超高分辨率小动物超声已用于评价小鼠心血管及移植物血流动力学相关研究领域[4,13]，还可用于检测ApoE小鼠腹主动脉瘤中血栓等[14]。

大鼠腹主动脉移植模型可用于评价聚合物材料的生物相容性。本研究应用高分辨动物超声测量大鼠腹主动脉移植模型PCL-肝素人工血管的血管内径、管壁厚度、血流速度以及血管移植后通畅情况，发现人工血管管壁不断增厚，建模后1、2、3个月差异有统计学意义(F=16.92，P<0.01),但血流状态保持稳定，建模后1、2、3个月血管内径及血流速度差异均无统计学意义(F=0.08、0.58，P=0.99、0.59)，即PCL-肝素人工血管移植后生长良好，未发生血栓形成、管腔狭窄、过度增生等情况。但本研究发现部分PCL-肝素人工血管出现动脉瘤样扩张，血流速度明显降低，具体原因还有待今后进一步实验分析。

总之，高分辨动物超声可作为检测大鼠腹主动脉移植模型的重要实验工具，具有广阔应用前景。