3种LED光与紫外线照射对表皮黑素细胞数目、树突长度及增殖的影响研究

宋玉杰，雷铁池

（武汉大学人民医院，湖北武汉430060）

近十年，许多新型发光二极管（Light-emitting diodes，LED）光疗设备进入临床，对多种皮肤病（如痤疮、皮炎、甚至秃发等）的治疗取得积极满意疗效[1］。不同波长的LED光有着不同的光生物调节（Photobiomodulation）活性，譬如蓝光（400～470 nm）能抑制皮脂分泌、还能杀灭痤疮丙酸杆菌用于治疗寻常型痤疮[2］；红光（630～700 nm）可抑制角质形成细胞（Keratinocyte，KC）释放促炎因子用于治疗玫瑰痤疮[3］；黄光（570～590 nm）可收缩血管消除皮肤红斑用于减轻激光术后皮肤红肿[4］。然而，也有报道称LED蓝光照射可诱导皮肤出现色沉等不良反应[5］。相反，LED黄光照射又能抑制皮肤黑素合成[6］。本研究用3种LED（红、黄、蓝）光照射体外分离培养的人表皮片，同时与经典光疗UVA与308 nm准分子光（308 nm excimer light，308 nm EL）进行平行比较，系统观察LED光照射对人表皮内黑素细胞（Melanocyte，MC）数目、树突长度以及细胞增殖影响。最后用LED光照射小鼠尾部皮肤进一步体内观察黑素颗粒含量与分布的变化，旨在阐释LED光疗是否存在直接引起皮肤色素沉着不良反应的风险。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 人包皮组织标本15例获自本院泌尿外科门诊行包皮环切术的患者，男，年龄18～25岁。本研究经武汉大学人民医院伦理委员会批准并签署知情同意书。小鼠melan-a MC由美国国家健康研究院Dr.Vincent J.Hearing提供。C57BL6小鼠18只，雌性，6周龄，体质量约20 g，购自武汉大学实验动物中心，饲养于武汉大学人民医院SPF级动物房。

1.1.2 主要试剂与仪器 Trizol试剂、逆转录（RT）和PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；EdU，EpiLife培养基及人KC生长添加成分（HKGS）购自（美国ThermoFisher公司）；L-3，4-二羟基苯丙氨酸（Dopa）购自美国Sigma公司；抗c-kit抗体（货号：MA5-12944，美国 ThermoFisher公司）；抗 Dct抗体（αPEP8h）和抗 Tyrp-1（αPEP1h）由 Dr.Vincent J.Hearing惠赠。本研究使用光源：UVA光（350 nm，美国Daavlin靶向光疗仪）、308 nm EL（日本USHIO光疗仪）、430 nm蓝光/585 nm黄光/630 nm红光（LED光疗仪，武汉博健光电子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 人表皮片制备与多巴染色 取健康人包皮环切术后组织，将标本剪成1 cm×1 cm大小，置于0.25%Dispase酶中4℃消化过夜。次日用镊子将表皮与真皮撕开，弃去真皮。角质层向上基底层向下平铺置于培养皿中，滴加EpiLife完全培养基于表皮片上。按照预实验摸索的参数：UVA（5 J/cm2）、308 nm 准分子光（250 mJ/cm2）、LED红光（108 J/cm2）、LED 黄光（18 J/cm2）、LED 蓝光（48 J/cm2），对皮片进行照光处理。将处理好的表皮片PBS洗2次，冷丙酮固定30 min，PBS洗3次，置于0.1%多巴染液中37℃避光孵育4 h，乙醇逐级脱水，将基底层向上角质层向下，置于载玻片上，中性树胶封片，正置显微镜下观察MC的数目及形态。每个视野下随机选取50个多巴染色阳性的MC，测量单个MC树突长度。

1.2.2 细胞培养与照光 RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、200 nmol佛波酯、100 μmol/L 二巯基乙醇、2 nmol/L谷氨酰胺）在37℃含5%CO2的培养箱中进行传代培养，指数生长期细胞用于实验。待细胞生长80%融合，吸出培养基，PBS漂洗2次，加入1 mL PBS，灯管照射距离为5 cm。照射后立即更换新鲜培养基。光疗参数在表2下备注。照光后继续培养8 h抽提细胞总RNA。

1.2.3 动物模型 实验动物随机分为6组，每组3只，即假照射组，UVA组，308 nm EL组和3种LED光组。小鼠尾巴背侧进行照光，灯管距小鼠尾巴背部距离为10 cm，隔日1次，共3次。照光完成后2 d CO2窒息处死小鼠，予超净工作台分离小鼠尾巴皮肤组织，4%多聚甲醛固定。

1.2.4 Fontana-Masson染色 参照本室以前报道的方法[7］。制备石蜡切片，行Fontana-Masson染色染色，显微镜下观察并摄像。

1.2.5 EdU标记及免疫荧光染色 将照光处理的表皮片角质层朝上，基底层朝下置于EpiLife培养基中，加入10 μmol/L的EdU，予培养箱中孵育8 h，用于掺入标记增殖的细胞。随后用一抗：Dct（1∶200）、Tyrp-1（1∶200）、c-kit（1∶100）4℃冰箱避光孵育24 h，最后孵育二抗，用含DAPI染液孵育显示细胞核。基底层朝上角质层朝下置于载玻片上封片。荧光显微镜下观察并摄像。

1.2.6 qPCR检测Rac1和RhoA mRNA的表达Trizol法提取细胞中总RNA，逆转录合成第1链cDNA。引物序列：鼠Rac1，正向引物5’-AGAGTACATCCCCACCGTCT-3’，反向引物 5’-TAAGAACACGTCTGTCTGCGG-3’；鼠 RhoA，正向引物 5’-ACGGTGTTTGAA AACTATGTGG-3’，反向引物 5’-GACAGAAATGCTTGACTTCTGG-3’；鼠GAPDH，正向引物5’-GACAAAATGGTGAAGGTCGGT-3’，反向引物5’-GAGGTCAATGAAGGGGTCG-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃ 30 sec；95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，共40个循环。重复3次。

2结果

2.1 比较3种LED光与紫外线对MC树突长度及黑素合成的影响 为了能准确观察到MC对不同光疗的反应性，笔者制备人表皮片（维持体内MC与KC共存状态），并给予5 J/cm2UVA或250 mJ/cm2308 nm EL 照射，于照射后不同时间（0、2、6、8、12 h）对表皮片进行多巴染色。结果显示2种紫外线照射8 h后，MC形态变化最明显，且两极或多极细胞数

表1 UVA与308 nm EL照射后不同时间表皮片中两极或多极MC数目比较 （±s）

表1 UVA与308 nm EL照射后不同时间表皮片中两极或多极MC数目比较 （±s）

组别 0 h 2 h 6 h 8 h 12 h UVA 35.24±2.14 41.26±4.33 44.32±2.45 54.19±3.14 48.28±4.86 308 nm EL 34.74±2.34 45.60±3.48 47.11±2.87 63.52±1.99 52.01±5.36 t 0.194 2.95 2.53 5.09 2.79 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.05

目较假照射组明显增加（P＜0.05），见表1。为此，选择照射后8 h，不同光源对人表皮片MC树突长度影响进行平行比较，典型多巴染色照片见图1。3种LED光照射对表皮片中MC数目及树突长度与假照射组比较差异无统计学意义，见表2，而UVA和308 nm EL照射组MC数目及树突长度与假照射组比较差异有统计学意义（P＜0.01），尤以308 nm EL组最为明显。与假照射组相比，UVA和308 nm EL处理melan-a细胞Rac1 mRNA水平明显升高，而Rho A mRNA变化不明显；3种LED光照组Rac1变化不明显，而Rho A表达水平增加，见表2。不同光疗对小鼠尾部皮肤照射后发现仅UVA和308 nm EL处理组可见基底层沉积有大量黑素颗粒，而3种LED光疗处理组未见黑素颗粒沉积，见图2，表2。以上体内和体外实验表明唯有UVA和UVB对表皮MC存在显著光生物刺激作用，而3种LED光疗作用不明显。

图1 3种LED光与UVA/308 nm EL照射后表皮片中MC形态变化 a：假照射组；b：UVA组（5J/cm2）；c：308 nm EL组（250 mJ/cm2）；d：LED 红光组（108 J/cm2）；e：LED 黄光（18 J/cm2）；f：LED 蓝光（48 J/cm2）。标尺：100 m。

表2 人表皮片不同光疗照射后8 h MC树突长度、小鼠尾皮肤黑素含量以及melan-a细胞2个树突调控基因mRNA表达水平的比较 （±s）

表2 人表皮片不同光疗照射后8 h MC树突长度、小鼠尾皮肤黑素含量以及melan-a细胞2个树突调控基因mRNA表达水平的比较 （±s）

注：与假照射组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。melan-a细胞照射剂量分别为 UVA 5 J/cm2、308 nm EL 70 mJ/cm2、LED 红光 5 J/cm2、LED 黄光 10 J/cm2、LED 蓝光 10 J/cm2。

melan-a小鼠MC（mRNA水平）Rac1 RhoA假照射组 12.70±1.94 15.01±2.35 1.0±0.26 1.0±0.27 UVA 组 31.28±2.53** 19.09±2.70* 1.46±0.14* 0.89±0.08 308 nm EL 组 78.51±4.68** 45.06±5.86** 2.48±0.15** 0.64±0.16红光组 8.20±2.03 12.10±1.55 1.19±0.14 3.13±0.25**黄光组 12.53±2.54 12.27±2.61 0.88±0.06 2.19±0.11**蓝光组 8.99±1.20 13.34±2.57 1.23±0.08 3.18±0.28**组别 人表皮片MC树突长度（μm）小鼠尾皮肤黑素含量

2.2 308 nm EL对体外培养的人表皮片中MC增殖活性的影响 为了观察308 nm EL照射后表皮MC是否发生增殖，笔者用EdU掺入法标记人表皮片中增殖的细胞。同时，用MC特异性抗体：c-kit（未成熟MC标志分子）、Tyrp-2/Dct（MC特异性谱系标志分子）和Tyrp-1（成熟MC标志分子）进行免疫荧光染色[8-9］，见图3。308 nm EL照射后的表皮片中，ckit+/EdU+和Dct+/EdU+共表达的细胞数量明显高于假照射组（P＜0.01），而 Tyrp-1+/EdU+共表达的细胞数量较低（P＞0.05）。这一结果提示UVB光疗主要诱导未成熟的MC而不是成熟的MC增殖。

3 讨论

图2 3种LED光与UVA/308 nm EL照射C57小鼠尾部皮肤黑素含量和分布（Fontana-Masson染色）a：假照射组；b：UVA组；c：308 nm EL组；d：LED红光组；e：LED黄光；f：LED蓝光组照射剂量同图1，隔日1次，共3次。标尺：50 m。

图3 MC和EdU双标免疫荧光染色 白色箭头表示有代表性的MC和EdU+的双标免疫染色图像（c-kit+和Tyrp-1+图片未提供）。标尺：50 m。统计每100个EdU+的细胞中c-kit+/Dct+/Tyrp-1+的细胞数目。＊＊表示P＜0.01。

近年来，许多新型的LED（主要提供420～650nm波长的光源）光疗设备被投入临床，广泛用于治疗痤疮、皮肤炎症甚至脱发等多种皮肤病[1，10］。有研究表明蓝光和红-蓝光有一定的抗炎和抗脂溢性作用，因此被用来治疗轻度痤疮[11］。然而，也有学者们担心LED光在治疗皮肤疾病时可能会出现照射部位皮肤过度色沉的不良反应[11］。为了阐释LED光疗是否真正地改变表皮MC的表型，笔者用分离制备的人表皮片模型（该模型保留着体内MC与KC的生理联系）观察了红、黄、蓝3种LED光疗对培养人表皮片MC形态学特征的影响。结果表明3种LED光照射组与假照射组比较未见树突长度延伸。相反，UVA和308 nm EL照射后树突增加显著。3种LED光疗照射C57小鼠尾部皮肤观察MC表型改变，结果与人表皮片结果一致。

已有研究显示Rho家族小GTP酶（Rac1和RhoA基因）在肌动蛋白细胞骨架的重组中起关键作用。Rac1激活诱导树突延伸，RhoA激活抑制树突生成并促其收缩[12-14］。笔者用qPCR技术检查了melan-a细胞在不同光疗处理前后2个树突相关调节基因的变化。结果提示3种LED光照不能上调促树突形成的Rac1基因表达，相反抑制树突生成基因RhoA表达水平增加。最后，笔者用EdU标记和免疫荧光染色技术观察了308 nm EL对人表皮片中MC增殖活性的影响。结果发现308 nm EL光疗主要诱导未成熟的而不是成熟的MC增殖，这一观察对提高UVB光疗诱导白癜风复色有重大意义。

综上所述，3种LED光疗对培养人表皮片MC未见有明显的光生物刺激活性。文献中零星报道的LED光疗导致照射部位皮肤色沉是否与LED光照射有直接关联，还是一种炎症后色素沉着有待更进一步证实。