蛋氨酸、半胱氨酸及苏氨酸对啤酒酵母产二氧化硫和乙醛的影响

毛江川，王金晶，郑飞云，刘春凤，钮成拓，李崎*

1(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 2(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)

啤酒老化是啤酒行业亟待解决的问题，不仅对啤酒风味及风味稳定性产生严重的不利影响，还降低啤酒的新鲜度和缩短其货架期。风味稳定性是评价啤酒质量的重要指标之一，其中SO2是啤酒中最有效的风味稳定剂和抗氧化剂之一，通过与H2O2反应清除啤酒中的氧自由基，从而有效提高啤酒抗氧化能力[1-3]。乙醛是啤酒中含量最高的羰基化合物，与啤酒老化直接相关[4]，其形成过程与酵母的能量代谢密切相关。过高的乙醛含量给啤酒带来生青味和腐烂苹果味等不良风味，同时影响啤酒的风味稳定性。

与硫代谢相关的蛋氨酸、半胱氨酸和苏氨酸对啤酒酵母产SO2存在一定的影响，而对乙醛产量的影响报道甚少。为探究啤酒酵母中总SO2和乙醛产量的影响因素及两者产量之间的关系，本研究将这3种氨基酸添加于麦汁中，分析其对啤酒酵母总SO2和乙醛产量的变化情况，同时利用BiWort和BiGGY平板来定性分析3种氨基酸引起啤酒酵母SO2产量变化的原因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与培养基

YEPD培养基(g/L)：酵母浸出粉10，蛋白胨20，无水葡萄糖20，115 ℃下灭菌15 min。

BiGGY培养基(g/L)：酵母浸出粉1，甘氨酸10，无水葡萄糖20，Na2SO31，柠檬酸铋铵1，琼脂粉16，115 ℃下灭菌15 min。

麦汁培养基：12 °P自制麦汁，105 ℃下灭菌10 min。

BiWort培养基(g/L)：12 °P自制麦汁，柠檬酸铋铵1，琼脂粉16，105 ℃下灭菌10 min。

1.1.2 试剂

酵母浸出粉、蛋白胨、琼脂粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；无水葡萄糖、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、亚硫酸钠，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸铋铵、乙醛(色谱纯)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；3-庚酮(色谱纯)，Sigma-Aldrich公司；麦芽，中粮集团有限公司。

1.2 仪器与设备

阿贝折光仪，上海豫光仪器有限公司；紫外可见分光光度计(UV-2000)，尤尼柯(上海)仪器有限公司；高压灭菌锅(HVE-50)，日本Hirayama公司；自动顶空进样气相色谱仪(GC-2010)，日本岛津(Shimadzu)公司；台式冷冻离心机(5804 R)，德国Eppendorf公司；生化培养箱(SPX-250)，上海跃进医疗器械有限公司；生化培养箱(BSP-250)，上海博讯实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒发酵实验

挑取一环啤酒酵母菌株于10 mL 12 °P麦汁试管中，28 ℃培养36 h后转接1 mL菌液于9 mL 12 °P麦汁试管中，25 ℃培养36 h后转接入70 mL 12 °P麦汁，23 ℃培养48 h后转接入300 mL 12 °P麦汁，接种量为1×107CFU/mL。摇匀后扣上发酵栓，用无菌水密封发酵栓后11 ℃发酵7 d。为研究蛋氨酸、半胱氨酸和苏氨酸对啤酒酵母总SO2和乙醛产量的影响，在麦汁中分别添加质量浓度为100 mg/L和200 mg/L三种氨基酸。

1.3.2 盐酸副玫瑰苯胺法测定发酵液中总SO2含量

参照文献[19]中盐酸副玫瑰苯胺法测定发酵液中总SO2含量。将发酵液在5 000×g离心5 min后取上清液，上清液中SO2与5%甲醛和盐酸副玫瑰苯胺发生反应产生紫色络合物，在550 nm波长处检测其吸光值，其总SO2的标准曲线方程为y=0.028 88x-0.007 23 (R2=0.999 2)。

1.3.3 顶空气相色谱法测定发酵液中乙醛含量

将发酵液离心后取上清，参照文献[20]中方法进行发酵液中乙醛的检测。分别添加4 mL发酵液、1 mL 30 mg/L 3-庚酮内标和1.8 g NaCl于顶空瓶。检测条件为：FID检测器温度为250 ℃；色谱柱由初始温度40 ℃以10 ℃/min升至180 ℃。

1.3.4 比重瓶法测定发酵液中乙醇含量

取经滤纸过滤后的发酵液100 mL，并加入50 mL去离子水于圆底烧瓶进行蒸馏，将100 mL馏出物进行比重瓶法测定，计算比值后查阅GB/T 4928—2008啤酒分析方法，其对应值为发酵液中乙醇体积分数(φ)。

2 结果与分析

2.1 啤酒酵母中总SO2和乙醛产量的关系

表1 典型啤酒酵母菌株中总SO2和乙醛产量Table 1 The production of total SO2 and acetaldehydein brewer’s yeasts

注：同一行不同字母代表显著性差异(P<0.05)。

加黑代表啤酒酵母菌株中表达上调，浅色代表啤酒酵母菌株中表达下调图1 啤酒酵母中含硫氨基酸和乙醛代谢图Fig.1 Sulfur amino acid and acetaldehyde metabolism in brewer’s yeast

2.2 硫代谢关键氨基酸对啤酒酵母总SO2和乙醛产量的影响

2.2.1 外源蛋氨酸对啤酒酵母总SO2和乙醛产量的影响

表2 外源添加蛋氨酸对啤酒酵母产总SO2、乙醛和乙醇的影响Table 2 Effects of methionine on total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表显著性差异(P<0.05)。

图2 蛋氨酸对啤酒酵母D-A-14和中还原酶活性和S2-产量的作用Fig.2 Effects of methionine on sulfite reductase activityand sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.2.2 外源半胱氨酸对啤酒酵母总SO2和乙醛产量的影响

表3 外源添加半胱氨酸对啤酒酵母产总SO2、乙醛和乙醇的影响Table 3 Effects of cysteine on in total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表显著性差异(P<0.05)。

图3 半胱氨酸对啤酒酵母D-A-14和中还原酶活性和S2-产量的作用Fig.3 Effects of cysteine on sulfite reductase activity and sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.2.3 外源苏氨酸对啤酒酵母总SO2和乙醛产量的影响

表4 外源添加苏氨酸对啤酒酵母产总SO2、乙醛和乙醇的影响Table 4 Effects of threonine on total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表显著性差异(P<0.05)。

图4 苏氨酸对啤酒酵母D-A-14和中还原酶活性和S2-产量的作用Fig.4 Effects of threonine on sulfite reductase activity and sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.3 啤酒酵母中总SO2和乙醛产量的相关性

图5 啤酒酵母中添加3种氨基酸后总SO2和乙醛产量的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between total SO2 andacetaldehyde production by addition of three amino acids in brewer’s yeast

3 结论