微生物标准菌株不同保藏方法的比较

林嘉欣，安 东，刘 莹，孙雪莲，孙小红

（大连出入境检验检疫局技术中心庄河分中心，辽宁大连 116400）

标准菌株是实验室不可缺少的一部分，一般由美国模式培养物集存库、中国工业微生物菌种保藏管理中心等菌株保藏机构提供，其遗传特性得到了确认、保证和可追溯性。实验室常将标准菌株应用于检测方法比较、培养基技术验收、检测阳性对照、人员技术比对、仪器设备性能的监控[1]等，是微生物检测质量控制的重要手段之一[2]。而菌株保藏是一切微生物工作的基础，其目的是使菌株被保藏后减少死亡、变异、被杂菌污染，并保持其良好的活性[3]。因此，实验室在选择标准菌株的保藏方法时至关重要。至今，现有的菌株保藏方法几十种，笔者只选择其中3种方法进行比较，从操作、保藏时间、占用空间和菌株存活情况4个方面进行分析，从而比较出3种保藏方法中保藏效果最优的方法。

1 菌株保藏的原理

为了能够长期保持标准菌株的良好活性，如何降低因微生物旺盛生长、繁殖而引起的标准菌株变异率就成为核心问题，因此必须创造一种良好的环境，能够降低微生物的新陈代谢，使微生物生长繁殖迟缓。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

实验室标准菌株来源，美国模式培养物集存库、中国工业微生物菌种保藏管理中心。

2.1.2 试剂、培养基及器材

半固体琼脂、无菌液体石蜡，均购于青岛高科园海博生物技术有限公司提供；新鲜牛奶；菌株保藏管。

2.2 方法

2.2.1 半固体琼脂石蜡保存法

配制好半固体琼脂培养基，分装试管，于121℃下高压灭菌15 min，垂直放置凝固后备用。

用接种针挑取复活后的标准菌株菌落垂直穿刺于半固体琼脂培养基中，接种针距离试管底部1/3处即可，多次穿刺。接种完的半固体琼脂菌株管放于培养箱培养后，在无菌的环境下，取适量灭菌的液体石蜡滴加于半固体琼脂菌株管表面，放于4℃冰箱中保藏，一年需要进行转种鉴定1次。

2.2.2 细菌湿种牛奶冻存法

将新鲜牛奶煮沸，冷却后脱去上层脂肪层，分装小试管，每管1 mL，灭菌后备用。将标准菌株划线接种于平板，分离培养后，用接种环刮取2～3环菌落接种于牛奶中充分混匀，放于-20℃冰箱中保存。使用时，取出菌株管放于室温下溶解，待部分溶解时即可取出1环划线接种于平板，并将菌株管再迅速冻存，每个菌株管可反复使用3～5次[4]。此法一般菌株可存活5年左右。

2.2.3 菌株保藏管法

菌株保藏管法是通过利用成品化的菌株保藏管对需要保藏的菌株进行保藏，它是一种用于菌株保藏或转移的容器[5]。挑取复活后的菌株制成菌悬液，接种到菌株保藏管中混匀，使菌株吸附在每个磁珠上，然后用无菌吸管将保藏管中多余的液体吸出，在保藏管壁上标记菌株的信息及接种时间，将菌株保藏管置于-70℃的超低温冰箱中保藏，可保存10年。菌株复苏时，只要取出菌株保藏管，不要解冻，用接种针或镊子取出磁珠划线接种于固体培养基或直接置于液体培养基中培养。菌株保藏管使用后要尽快放回超低温冰箱中保藏。

3 结果与分析

不同种标准菌株保藏方法存在的利弊不同，因此对每种保藏方法从操作、保藏时间、占用空间和菌株存活情况进行具体分析和比较。

3.1 半固体琼脂石蜡保存法

（1）该方法前期准备工作比较繁琐，需要进行培养基的配制，而且菌株保藏过程中需要定期加入无菌液体石蜡。

（2） 该方法每年需要转种1次，而《中国药典》（2015年版）明确规定“菌株的传代次数不得超过5代（从菌株保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代）”[6]，因此该方法保藏菌株时间较短。

（3）需要垂直保藏，占用空间较大。

（4）菌株不易发生污染、变异等问题。

3.2 细菌湿种牛奶冻存法

（1）该方法前期准备工作相对繁琐。

（2）保藏时间较长。

（3）试管体积偏大，占用菌株保藏空间较大。

（4）使用时需要室温溶解，可能会出现培养基变质等问题，并且反复使用容易造成菌株污染、变异、活性降低等。

3.3 菌株保藏管法

（1）该方法操作简单，减少了菌株保藏的前期准备工作。

（2）菌株保藏时间长，减少了定期转种的麻烦。

（3）保藏管体积较小，能够节省保藏空间。

（4）该方法不会发生因培养基变质而使菌株发生变异、污染、活性降低等问题。

对3种不同标准菌株保藏方法进行比较。3种不同保藏方法的比较见表1。

表1 3种不同保藏方法的比较

4 结论

阐述了3种不同的菌株保藏方法，从操作、保藏时间、占用空间和菌株存活情况4个方面进行比较：从操作方面看，半固体琼脂石蜡保存法和细菌湿种牛奶冻存法的前期准备工作相对繁琐，而菌株保藏管法减少了这方面的麻烦，从而减少了人力的输出；从保藏时间方面，半固体琼脂石蜡保存法保藏时间短，需要定期转种，菌株管理比较麻烦，而细菌湿种牛奶冻存法和菌株保藏管法保藏时间较长；从占用空间方面，半固体琼脂石蜡保存法和细菌湿种牛奶冻存法都是用试管来保藏菌株，占用很大空间，菌株保藏管体积小，节省保藏空间；从菌株存活情况方面，细菌湿种牛奶冻存法可能因转种过程中培养基变质导致菌株发生变异、污染、活性降低等问题。综上可以看出，菌株保藏管法要优于另外2种方法。