秦皇岛地区貂源大肠杆菌(E.coli)的分离鉴定及药敏试验分析

2019-05-21肖丽荣李巧玲张艳英张召兴贾青辉史秋梅

中国兽医杂志 2019年1期

肖丽荣,周琦,李巧玲,张艳英,张召兴,2,贾青辉,史秋梅

(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北秦皇岛 066604；2.河北旅游职业学院畜牧兽医系,河北承德 067000)

水貂大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起水貂一种常见的肠道传染病,该菌可以感染各个年龄段的水貂,尤其是40～60日龄的幼貂最易感,临床上主要表现急性败血型、腹泻、痉挛、神经症状等,发病率和死亡率均较高,给水貂养殖业造成严重的经济损失[1]。大肠杆菌(E.coli)是一种存在环境中条件致病菌,血清型复杂,该菌引起多种动物及人发病,造成严重的局部或全身性感染[2]。2012年史秋梅等[3]报道了引起水貂严重腹泻的E.coli血清型为O78、O38、O29具有很强的致病性。E.coli引起不同日龄水貂腹泻、肠炎,甚至呈急性死亡[4]。E.coli易产生耐药性,由于在养殖水貂的过程中大量不合理使用抗菌药物,导致E.coli耐药菌株不断出现,许多敏感药物变为耐药,其耐药谱不断增大,导致动物体内大量的抗菌药物残留,从而形成药物恶性循环[5]。本试验对秦皇岛地区不同养殖场腹泻水貂的肠内容物及粪便,利用细菌常规的方法,分离鉴定出42株致病性E.coli,进行药敏试验分析,结果表明,该地区水貂E.coli的具有很强耐药性,为该地区水貂源E.coli防控提供依据。

1 材料

1.1 病料来源秦皇岛地区不同水貂养殖场采集腹泻水貂的肠内容物及粪便等进行分离培养。

1.2 主要试剂药敏纸片、微量发酵管由北京天坛药物生物技术开发公司生产；伊红美蓝培养基、普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基由青岛高科园海博生物技术有限公司生产；ID32E肠道菌鉴定试剂条由法国梅里埃公司生产；常规仪器与试剂均由本实验室提供。

1.3 实验动物体重22 g左右健康昆明系小鼠180只,购自于北京维通利华实验动物有限公司。

2 试验方法

2.1 细菌分离纯化采集腹泻水貂的肠内容物及粪便处理后划线接种于麦康凯琼脂培养基37℃恒温培养12～24 h,挑取优势菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基进行培养,并在在普通琼脂培养基进行纯化培养。

2.2 细菌形态特征无菌挑取通过伊红美蓝琼脂培养基及普通琼脂培养基进行纯化培养后菌落,经革兰染色镜检。

2.3 细菌生化特性鉴定利用ID32E肠道菌鉴定试剂条及微量发酵管,按说明书进行操作,用ATB全自动生化鉴定系统进行生化试验鉴定。

2.4 致病性试验试验组每株菌攻毒4只小鼠,剂量按0.2 mL/只,腹腔注射(5×108CFU/mL),对照组4只小鼠注射等量的营养肉汤。观察发病及死亡情况,剖检小鼠对其肝、肺等组织进行分离鉴定。

2.5 药敏试验按照K-B纸片法进行试验操作和结果判断[6]。取分离纯化的分离菌接种营养肉汤,37℃震荡培养12 h～15 h,使菌液浓度调整至0.5号麦氏标准管浊度,涂抹于琼脂平板,贴上药敏片,置37℃培养16 h～18 h,测定抑菌圈直径。美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准

3 结果分析

3.1 细菌分离纯化与形态观察分离菌在麦康凯琼脂培养基上长出呈粉红色、边缘光滑整齐、湿润的扁圆的菌落；伊红美蓝培养基上长出深紫黑色、带金属光泽的圆形菌落。在普通琼脂平板上长出白色、光滑湿润的菌落。革兰染色镜检,分离菌为革兰阴性菌,两端钝圆,短小杆状菌。

3.2 生化试验结果该42株分离菌株吲哚试验为阳性、V-P试验为阴性,均能产酸不产气,不分解尿素,发酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖等。用ATB全自动生化鉴定系统进行检测分析,鉴定结果为均E.coli,评定结果合格率为99.3%。

3.3 致病性试验试验组小鼠24～48 h左右发病死亡,进行剖检和细菌分离培养鉴定。结果显示,从死亡的小鼠体内分离的菌与该菌一致。对照组4只小鼠健康存活,表明该分离菌株有一定致病性。

3.4 药敏试验结果与多重耐药分析由表1药敏试验结果可见,34株水貂源致病性E.coli对头孢克肟、氟苯尼考、阿米考星等高度敏感；对新霉素、氨苄西林、红霉素等中度敏感；其中复方新诺明、阿莫西林、四环素、耐药率最高达100%,磺胺间甲氧异恶唑耐药率87.7%,其他药物耐药率为40.4%～75.0%之间

根据药敏结果,由表1和表2可以看出,该地区的水貂源致病性E.coli呈多重耐药。其中耐13种药物的菌株数最多达12株,耐15种药物的细菌有2株,耐14种药物的细菌有3株,耐12种药物的有7株,耐10种药物的有5株,耐9种药物的有2株,耐8种药物的有3株。

4 讨论

秦皇岛地区不同养殖场腹泻水貂的肠内容物及粪便中分离鉴定出42株致病性E.coli,从形态学观察、培养特性分析、生化鉴定等方面特性与《伯杰细菌鉴定手册》报道一致。通过人工感染试验小鼠,试验组小鼠发病死亡,对照组4只小鼠健康存活,从死亡的小鼠体内分离的菌与该菌一致。证实该菌有一定致病性。E.coli是引起不同日龄水貂腹泻的主要病原菌。相关报道了2011-2013年间山东10个不同水貂养殖场E.coli感染率为14.04%[7]。潘德芹等[8]报道山东地区241份水貂病料中检出致病性E.coli占11.2%。该菌对我国水貂养殖造成很大的危害。

本试验对其秦皇岛地区分离的34株水貂源致病性E.coli对常用的18种抗菌药物进行了药敏试验,分析其耐药性。药敏试验结果显示,34株致病性E.coli仅头孢克肟、氟苯尼考、阿米考星等4种药物高度敏感；对阿莫西林、四环素等4种药物耐药率达100%,该地区的水貂感染的E.coli具有很强的耐药性。与于杰等[9]报道的水貂源E.coli对氟喹诺酮类药物产生强的耐药性基本上一致。史秋梅等[3]报道了对腹泻水貂进行了药敏分析,对恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素敏感,与本试验药敏结果存在一定的差异性,可能与该菌携带的耐药基因有关。通过药敏试验分析表明,该地区的水貂源致病性E-.coli呈多重耐药性,且耐药菌在8种药物以上。孙蓉蓉等[10]报道,青岛地区10株貂源E.coli对18种抗生素不同程度的耐药,对氨苄西林、链霉素等耐药性大于50%,并且呈现多重耐药,其中2个菌株同时耐9种药,2个菌株同时耐4种药等。地域不同,其该菌的耐药性存在一定的差异,根据该菌易流行及易产生耐药特点,对其该菌进行药敏试验,分析其该菌耐药性,合理使用抗生素,降低该菌耐药性,才能起到良好的防治效果。