山羊 IL-1 β IL-8和 Mx1因子实时荧光定量检测方法的建立

孙文超,易驰喆,汪 伟,曹 亮,张世亨,闭璟珊,韦显凯,辛佳亮,李文杰,张克龙,郑 敏,鲁会军,张红云,苏姣秀

(1.温州大学病毒学研究所,浙江 温州 3250352；2.军事科学院军事兽医研究所,吉林 长春 130122；3.广西动物疫病预防控制中心,广西 南宁 530001；4.广西大学动物科技学院,广西 南宁 530004)

山羊和绵羊痘病毒属于痘病毒科,山羊痘属,该病毒粒子大小为椭圆形,为含囊膜的双链DNA病毒。山羊和绵羊痘病毒是主要感染山羊和绵羊这两种物种,未见野生偶蹄类动物感染病例。山羊和绵羊痘在非洲和亚洲的部分地区、中东以及印度次大陆的大部分地区都有发现。孟加拉国每年都会暴发山羊和绵羊痘,导致严重经济损失。该疫情主要见于冬末和秋末(当年10月份至次年4月份)。病毒经常在紧密接触时通过呼吸道传播,也可通过其他黏膜或磨损皮肤感染。病毒在唾液、鼻腔和结膜分泌物、乳汁、尿液和粪便以及皮肤损伤和结痂中经常检测到。黏膜上的溃疡是病毒扩散的重要来源。

使用减毒或灭活疫苗可能有助于预防和控制山羊和绵羊痘。然而目前关于羊痘病毒引起的相关炎性细胞因子和抗病毒因子的研究相对较少,本研究建立羊炎性因子(IL-1β和IL-8)和Mx1因子实时荧光定量检测方法,为山羊痘感染后的羊炎性和抗病毒因子在mRNA水平研究提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂 外周血单核细胞分离液试剂盒,购自北京索莱宝科技有限公司；总RNA抽提试剂盒,购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix,购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒小量提取试剂盒,购自杭州爱思进生命科学有限公司；ConA,购自碧云天生物科技研究所；MLV Reverse Transcriptase、SYBR Green Real-time PCR Master Mix,均购自Promega公司。

1.2 毒株、菌株和载体 山羊痘AV41株由广西壮族自治区疫控中心保存；感受态细胞DH5α,购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 仪器 Nanodrop 2000分光光度计、ABI Prismr 7500型荧光定量 PCR仪,均购自赛默飞Thremo公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的设计与合成 根据GenBank中羊IL-1β、IL-8和Mx1因子基因序列,利用引物设计软件PrimerExpress和Oligo7分别设计相应的引物序列(见表1),以上引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 Real-time PCR引物

1.4.2 cDNA样品的制备 无菌采集健康山羊抗凝血20 mL,分离外周血单核细胞。同时用Con A和PHA刺激12 h后加入TRIZol收集样品提取总RNA,将样品反转录后所得 cDNA置于 -20℃备用。

1.4.3 基因克隆 以制备的cDNA样品为模板进行IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子PCR扩增,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,胶回收纯化后连接到pMD-18T载体。将连接产物转化DH5α,LB平板上培养12 h,挑取单菌落,37℃恒温摇床上培养12 h后小量提取质粒,酶切鉴定正确后进行测序鉴定,将阳性质粒作为标准质粒。

1.4.4 标准品的制备 标准质粒样品使用Nanodrop 2000分光光度计分别测量浓度,根据换算公式计算各样品中重组质粒的拷贝数。IL-1β、IL-8和Mx1拷贝数分别是4.7×1010Copies/μL、9.32×109Copies/μL、9.97 ×109Copies/μL。 然后对标准品分别进行10倍梯度稀释,取不同稀释度的标准品作为模板。

1.4.5 标准曲线的建立 以稀释好的标准品为模板,对引物浓度和退火温度进行优化,筛选出最佳反应条件。随后以不同稀释梯度的标准品为模板,进行正式试验,Real-time PCR用SYBR GreenⅠ染料法进行测定。反应体系20 μL：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL；上游/下游引物各1 μL；模板1 μL；蒸馏水7 μL。系统将自动生成标准曲线、相关系数、扩增效率以及熔解曲线。

1.4.6 灵敏度试验以及重复性试验 将标准质粒做10倍梯度稀释,共稀释12个梯度。用稀释的样品模板(同时设置阴性对照)进行Real-time PCR反应,每个样品设置3个重复,检验该方法能检测到的最低拷贝数。同时以标准质粒为对照计算组间及组内的变异系数,分析试验的重复性。

1.4.7 山羊外周血淋巴细胞因子mRNA的实时定量PCR检测 利用本试验利用羊痘病毒AV41株和Con A分别刺激山羊外周血淋巴细胞因子,通过对IL-1β、IL-8和 Mx1细胞因子 mRNA水平进行检测。

2 结果

2.1 羊细胞因子基因片段的扩增及重组质粒标准品的制备 利用山羊外周血提取cDNA为模板基因组为模板,以IL-1β、IL-8和Mx1引物进行PCR扩增IL1β、IL-8和Mx1基因。结果显示,各自的目的片段与预期大小一致(图1)。重组质粒测序结果显示,成功构建羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子标准品。

图1 细胞因子的PCR鉴定结果

2.2 标准曲线的建立及熔解曲线分析 最终确定优化的反应体系如下：10 pmol/L上、下游引物各1 μL、2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL、模板1 μL,去离子水补至20 μL。 羊 IL-1β、IL-8 和 Mx1细胞因子重组质粒进行10倍梯度系列稀释,分别选取不同浓度的质粒进行荧光定量PCR扩增,同时每个稀释度做两个重复试验。结果表明羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子标准曲线Ct值和标准质粒浓度间呈现良好的线性关系,R2均大于0.990(图2)。

2.3 特异性检测结果 用建立的SYBR Green I荧光定量PCR进行扩增反应,结果显示未出现特异性扩增,只有1个特异性峰Tm值介于82.5℃～85.5℃之间,无引物二聚体及非特异性扩增产物出现。

2.4 敏感性检测结果 以10倍系列稀释的质粒DNA为模板,对标准品进行SYBR Green I荧光定量PCR。结果显示,IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子检测体系检出下限分别为4.7×103Copies/μL、9.32×103Copies/μL、9.97 ×101Copies/μL。

2.5 重复性检测结果 将不同稀释度羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子标准品质粒进行SYBR Green I荧光定量PCR,用统计学软件分析结果,表明建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法组间变异系数为0.664% ～1.09%,组内变异系数为0.77% ～1.56%,组内和组间变异系数均在2%以内表明重复性和稳定性好。

图2 IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子Real-time PCR标准曲线

表2 羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量PCR检测重复性试验

2.6 山羊外周血淋巴细胞因子mRNA的实时定量PCR检测结果 本试验利用羊痘病毒AV41株和Con A分别刺激山羊外周血淋巴细胞,通过对IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子mRNA荧光定量检测。试验结果表明,山羊外周血淋巴细胞中羊炎症因子IL-1β和IL-8 mRNA表达水平与Con A对照组相比均有明显差异,羊痘感染可以促进机体产生大量的炎症因子。羊痘感染组Mx1细胞因子明显低于Con A对照组,表明羊痘病毒在复制过程中可能抑制了机体的先天免疫应答(图3)。

图3 山羊外周血淋巴细胞因子mRNA表达分析

3 讨论

I型干扰素(IFN)是天然免疫反应的重要介质,对于限制病毒的早期复制和传播至关重要。I型IFN的重要下游效应因子是黏病毒抗性基因(小鼠和猪Mx1、人MxA)[1]。Mx基因几乎存在于从鱼类到灵长类动物的所有脊椎动物的基因组[2]。不同物种的Mx蛋白具有不同的抗病毒活性,并且Mx蛋白的亚细胞定位有助于抗病毒作用[3]。IFN-α/β、双链RNA或病毒感染能够诱导Mx1的高水平表达[4]。Mx1蛋白可以在体内外抑制多种病毒的生长,包括正黏病毒、布尼亚病毒、弹状病毒、副黏病毒和汉坦病毒[5]。研究表明,Mx1/MxA蛋白通过直接抑制病毒基因组的复制来发挥其抗病毒作用,因此Mx1具有广谱的抗病毒活性。炎症反应在病毒感染过程中起到至关重要的作用。白细胞介素IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)是主要的炎性细胞因子之一[6],IL-1β在炎症反应中是通过上调炎症基因基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)介导[7]。MMPs主要降解细胞外基质组分。基质金属蛋白酶在生理和病理过程中均参与ECM的重塑,包括器官产生/再生、血管生成、伤口愈合、炎症和肿瘤生长都是非常重要的[8]。此外,MMP-9涉及多种病理状况,如研究发现,这种高表达促炎性细胞因子血症对流感病毒感染的宿主防御反应。然而,高水平的促炎性细胞因子的存在会损害线粒体的能量代谢,导致细胞功能障碍和器官衰竭。白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8),又称为趋化因子8(CXCL8)[9]。早期研究发现,IL-8是内皮细胞的趋化和生长因子,后来研究发现IL-8的受体CXCR1和CXCR2结合从而使中性粒细胞趋化到反应部位,实现机体局部的炎症反应[10]。CXCR1和CXCR2受体也在各种肿瘤细胞广泛表达可以高亲和力结合IL-8[11]。

实时PCR荧光标记技术与传统的PCR相比敏感度高、省时、方便。该技术已经应用在流感病毒A和B、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等的检测和鉴别。本研究建立羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子的Real-time PCR检测方法,Tm值介于82.5℃～85.5℃之间；重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%；IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子检测体系检出下限分别为 4.7×103Copies/μL、9.32×103Copies/μL、9.97 × 101Copies/μL。 山羊炎症因子IL-1β、IL-8 mRNA水平均显著高于 ConA对照组,证实羊痘感染可以刺激机体产生大量的炎症因子。而羊Mx1细胞因子与Con A对照组相比均有明显较低,可能羊痘病毒在复制过程存在抑制机体免疫系统的抗病毒作用。例如羊痘病毒编码的N1蛋白同时具有抑制宿主细胞凋亡信号通路的能力。然而目前关于羊痘病毒的分子机制还不是很清楚。本研究利用荧光定量方法检测羊痘病毒IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子mRNA表达水平,为研究山羊痘感染后分子免疫机制的提供了可靠的技术支撑。