规模化猪场仔猪圆环病毒2型与3型混合感染的检测与控制

朱秀高,李艳青,史 红,徐伟超,方 浩

(1.武汉回盛生物科技股份有限公司,湖北 武汉 430042；2.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193 3.潍坊科技学院生物研发中心 ,山东 寿光 262700；4.回盛生物猪病研究院 ,湖北 武汉 430042)

猪圆环病毒(PCV)感染在猪场普遍存在,自出现以来,虽然有1型和2型两种基因型,但一直以2型为主致病,临床表现多以断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)为主。2016年Phan等报道PCV3型在美国引起母猪繁殖障碍和皮炎肾病问题[1],何其盖等随后报道了PCV 3型在国内猪场的发病情况[2]。从对病料的回顾性检测中发现,PCV 3型在国内存在已有较长时间,且很多出现PCV 3型感染的猪场都已经免疫过PCV 2型疫苗[3]。因此3型的出现加重了猪场PCV防控的压力。

2017年9月,山东某存栏1 300头母猪猪场反馈该场连续3批体重40 kg左右的生长猪出现以外观渐进性消瘦、皮肤丘疹样病变(见中插彩版图1),剖检以淋巴结肿大、肺间质增宽为主要特征的疾病(见中插彩版图2、3),发病率为15%,死亡率不到1%。经现场诊断与实验室检测确诊为PCV 2型和PCV 3型混合感染。

图1 发病猪消瘦、皮肤丘疹样凸起

图2 发病猪淋巴结肿胀

图3 发病猪肺间质增宽、出血及胶冻样渗出

1 材料与方法

1.1 材料 检测样品：A.组织病料：现场宰杀病猪3头,分别取其脾脏、淋巴结和肺脏组织冻存；B.唾液：用灭菌后的棉绳采集2个发病猪圈的圈内混合唾液样本2份冻存；C.血清：经前腔静脉采集发病猪血液15份,离心分离血清冻存；所有样品标记冻存后,送实验室进行PCR诊断,测定样品中是否存在PCV。

主要检测试剂：Transgen EasyPure Viral DNA/RNA Kit。

主要检测仪器：BIO-RAD PCR仪 S1000、天能1600凝胶成像系统。

引物：根据GenBank中公布的PCV相关全基因组序列和Ku等报道[2],分别设计针对 PCV2与PCV3 的引物：PCV2-F：5′-AAGGGCTGGGTTATGGTATGv3′、 PCV2-R： 5′-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3′、 PCV3-F：5′-TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG-3′、PCV3-R：5′-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3′,预期扩增片段分别为353 bp和649 bp。

1.2 方法 将组织病料用无菌生理盐水冲洗、研磨成组织悬液,反复冻融3次,6 000 r/min离心30 min取上清液,0.22 μm滤膜除菌后使用；血清和唾液经6 000 r/min离心30 min取上清,经0.22 μm滤膜过滤除菌后使用。处理的样品液按试剂盒推荐方法提取 DNA后进行PCR反应,反应体系：95℃预变性 5min、94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,30 个循环后72℃延伸10 min。取反应产物5 μL在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

2 结果与处理

2.1 结果 电泳后的凝胶图像(见中插彩版图4)显示,1、3、5、7、11、13、15、17 号和 19 号样品为PCV2阳性,10号和14号样品为PCV3阳性。

图4 送检样品PCV检测结果

综合临床、剖检及实验室检测结果,确诊该猪场发病是由PCV2和PCV3混合感染造成。

2.2 处理 针对确诊结果,建议猪场及时采取“增强抵抗力+抗病毒+防止继发感染+防应激”的措施,在生长猪阶段,每吨饲料添加茯苓多糖散500 g、10%磺胺二甲嘧啶+10%酒石酸泰乐菌素1 500 g和复方维生素+氨基酸+活菌添加剂2 000 g,连用15 d；母猪群及时间隔1个月免疫2次PCV 2型疫苗,饲料中添加茯苓多糖散500 g/吨,每月1次,每次15 d,连用3个月。

猪场反馈处理后5 d大群采食量开始上升、活动频率加大,10 d后被毛开始变得柔顺有光泽、消瘦情况逐步缓解,皮肤上的疹块逐步消退。

3 分析与建议

通过查阅该猪场的生产记录,并与生产各岗位人员交流发现,发病仔猪的母猪在5月份的圆环疫苗普免中由于人为因素出现漏免,造成免疫空白长达8个月,使得猪群特别是出生仔猪缺少母源抗体的保护。另一方面,该猪场7月份引入190头后备母猪40 d左右,场内少量经产母猪出现了以木乃伊为主要特征的中后期流产,怀疑乙脑感染直接采取淘汰措施后再未有新流产病例出现,错过了早期发现PCV潜在感染的机会。“漏免+引种带毒”两重因素叠加,造成了本次仔猪的发病。

虽然猪场自身管理因素是本次发病的主要原因,但检测中发现的PCV 3型问题应引起广大养猪从业人员的高度重视。近年来国内养猪业中频频出现的“旧病复发”问题,如仔猪病毒性腹泻(PED)、伪狂犬病(PRD)和蓝耳病(PRRS)等,究其主要原因都是出现了新基因型致病毒株,由于现有疫苗对此类流行毒的交叉保护力欠佳,导致这些疾病在全国范围快速暴发,给一线养猪生产造成巨大损失。PCV 3型病毒首次报道后,韩国[4]、意大利[5]、波兰[6]、巴西[7]和英国[8]等随后确认该国猪群出现了PCV 3型感染,国内如河北[9]、山东等13省[10]也检测发现存在PCV 3型感染。根据国内猪场圆环疫苗的免疫现状及临床调查,很多PCV 3型感染猪场都免疫过PCV 2型疫苗,此外,从基因型分析,PCV 2和PCV 3存在较大差异,进化树中两者属于不同分支。因此可以推测目前使用的PCV 2型疫苗不能给予PCV 3型感染以充分保护,两者交叉免疫保护力偏低。在目前尚无PCV 3型疫苗的情况下,猪场在面对PCV感染时应考虑如何在PCV 2型防控基础上进一步做好PCV 3型的控制,建议可以考虑采取“PCV 2疫苗+中药增强免疫+防止继发感染”组合来进行控制。