五氯柳胺混悬液抑菌效力测定

孙继超,姜兴粲,王玮玮,董 朕,周绪正,张继瑜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃 兰州 730050)

肝片吸虫病是由肝片吸虫引起的食源性人兽共患病,五氯柳胺作为水杨酰苯胺类化学合成抗蠕虫药物,主要用于防治牛羊动物的吸虫病、绦虫病和蛔虫病,对线虫有一定的治疗效果,其通过抑制虫体线粒体中氧化磷酸化过程从而阻碍三磷酸腺苷的生成,使虫体因能量耗尽而死亡[1-2]。五氯柳胺混悬液药物粒径小,颗粒粘附性高,相对于市售其他剂型,其药物吸收度好,分布面积大[3]。

1 材料

1.1 供试品 五氯柳胺混悬液(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所生产,规格：100 mL∶3.4 g,批号：20180605)。

1.2 供试菌株 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]、黑曲霉[CMCC(F)98 003]和白色念珠菌[CMCC(F)98 001]菌种0代,均购自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心,工作使用第3代传代菌种。

1.3 培养基 胰酪胨大豆液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA),均购自广东环凯微生物科技有限公司,经培养基的适用性检查,结果符合规定。

1.4 仪器 生物洁净安全柜(上海力申,HFsafe-1 200LC型)；隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司,GHP-9 270型)；振荡培养箱(上海知楚有限公司,ZQZY-75BN型)；全波长酶标仪(Thermo Fisher,Multiskan公司,GO-1 510型)；超低温冰箱(Thermo scientific公司,700系列)；高压灭菌锅(驰通仪器(上海)有限公司,CT62A型)；微量移液枪(Eppendorf公司,100 μL,1 mL)；一次性无菌培养皿(Thermo公司)。

2 方法

2.1 菌液的制备 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿芽孢杆菌、白色念珠菌以及黑曲霉的第3代新鲜培养物制备为108CFU/mL的菌(孢子)悬液,用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度约为100～1 000 CFU/mL的菌(或孢子)悬液[4]。

2.2 计数方法适用性

2.2.1 细菌计数方法适用性确认平皿法作为试验组 取制备好的供试液,以稀释液代替菌液同试验组操作,作为供试液对照组。取不含中和剂的相应稀释液替代供试液同试验组操作,作为菌液对照组。取含中和剂的相应稀释液替代供试液同试验组操作,作为中和剂对照组。

2.2.2 真菌和酵母菌计数方法适用性确认 常规法联合中和法：取五氯柳胺混悬液1 mL,分别置于2支无菌试管中,每管加入含0.5%碳酸氢钙的pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9 mL,混匀后,制成1∶10的供试液,混匀使每1 mL 1∶10的供试液中含菌(或孢子)量≤100 CFU,取此供试液1 mL,注入平皿中,倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基,平行制备2个平皿,待凝固后,置25℃培养5 d,观察并记录菌落数,作为试验组。取制备好的供试液,以稀释液代替菌液同试验组操作,作为供试液对照组。取不含中和剂的相应稀释液替代供试液同试验组操作,作为菌液对照组。取含中和剂的相应稀释液替代供试液同试验组操作,作为中和剂对照组[6]。

根据细菌、真菌和酵母菌计数方法适用性试验结果,计算中和剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值,计算试验组菌落数减去供试液对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值。

2.3 抑菌剂剂量验证试验 各取100 mL不加抑菌剂的五氯柳胺混悬液转移至15个无菌容器中,分为三组：五氯柳胺A组加入对羟基苯甲酸甲酯0.15 g/L；五氯柳胺B组加入对羟基苯甲酸丙酯0.1 g/L；五氯柳胺空白组不加入抑菌剂。

各取100 mL不加入五氯柳胺的混悬液转移至20个无菌容器中,分为四组：对照A组加入对羟基苯甲酸甲酯0.15 g/mL；对照B组加入对羟基苯甲酸丙酯0.1 g/mL；对照混合组加入对羟基苯甲酸甲酯0.15 g/mL和对羟基苯甲酸丙酯0.1 g/mL；对照空白组不加入抑菌剂。

上述8组分别接种上述试验菌108CFU,充分混合,将容器内的试验菌分布均匀。然后将接种后的容器置于20℃ ～25℃避光保存,并防止被污染。贮存过程中,分别在14 d和28 d分别从供试品中取1 mL稀释后,计数。根据菌落测定结果,计算1 mL供试品各间隔时间的菌数,并换算成lg值。

另取5个容器,加入0.9%氯化钠溶液10 mL,然后与样品组同法操作后用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释计数。根据菌落测定结果,计算1 mL供试品中始浓度菌数,并换算成lg值[7]。

2.4 抑菌效力试验 各取100 mL五氯柳胺混悬液供试品转移至5个无菌容器中,分别接种上述试验菌108CFU,充分混合,将供试品中的试验菌分布均匀。然后将接种后的供试品置于20℃～25℃避光保存,并防止被污染。贮存过程中,分别在14 d和28 d分别从供试品中取1 mL计数。根据菌落测定结果,计算1 mL供试品各间隔时间的菌数,并换算成lg值。

另取5个容器,加入0.9%氯化钠溶液100 mL,然后与样品组同法操作计数。根据菌落测定结果,计算1 mL供试品中始浓度菌数,并换算成lg值。

3 结果与分析

3.1 细菌、真菌和酵母菌计数方法适用性确认结果

中和剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值,试验组菌落数减去供试液对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值,均在规定范围内,方法适用性结果符合要求,说明细菌可采用平皿法联合中和法计数,真菌和酵母菌可采用常规法联合中和法对细菌进行计数。结果见表1。

表1 细菌计数方法适用性

真菌和酵母菌方法适用性试验结果：中和剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值,试验组菌落数减去供试液对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值,均在规定范围内,方法适用性试验结果符合要求,说明可采用常规法联合中和法对真菌和酵母菌进行计数。结果见表2。

表2 真菌和酵母菌计数方法适用性

3.2 抑菌剂剂量验证试验结果 抑菌剂剂量验证试验各时间段的菌落lg值见表3。由2015版《中国兽药典》一部附录1121抑菌效力检查法指导原则中的评价标准中规定,五氯柳胺混悬液按照“内服制剂、直肠给药制剂的抑菌效力判断标准”来进行评价。要求为：细菌14 d菌数下降不少于3 lg值,28 d相对于前一个测定时间,试验菌增加的数量不超过0.5 lg值；真菌14 d菌数下降不少于1 lg值,28 d相对于前一个测定时间,试验菌增加的数量不超过0.5 lg值。表3数据表明,添加抑菌剂对羟基苯甲酸甲酯0.15 g/L和对羟基苯甲酸丙酯0.1 g/L的混合组,与只添加对羟基苯甲酸甲酯0.15 g/L或只添加对羟基苯甲酸丙酯0.1 g/L的组相比,更加符合“内服制剂、直肠给药制剂的抑菌效力判断标准”的要求；且五氯柳胺本身具有一定的抑菌活性。

表3 抑菌剂剂量验证试验数据

3.3 抑菌效力试验结果 抑菌效力试验各时间段的菌落lg值见表4。由2015版《中国兽药典》一部附录1121抑菌效力检查法指导原则中的评价标准中规定,五氯柳胺混悬液按照“内服制剂、直肠给药制剂的抑菌效力判断标准”来进行评价。要求同3.2。表4数据表明,该供试品的抑菌效力对细菌和真菌能够达到“内服制剂、直肠给药制剂的抑菌效力判断标准”的要求。该供试品符合规定。

表4 抑菌效力试验数据

4 讨论

4.1 存活菌数的测定方法的确认 抑菌效力检查试验过程中,需要在规定的间隔时间测定每份供试品中存活菌数,因此存活菌数的测定方法的正确与否,直接关系能否真实反映药品抑菌效力的强弱。由于五氯柳胺混悬液具有一定的抑菌活性,对细菌和真菌均有抑菌作用,而碳酸氢钙能中和五氯柳胺的抑菌作用,因此在存活菌数的测定方法中采用含0.5%碳酸氢钠的pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂,该中和剂能中和该混悬剂中五氯柳胺的抑菌作用,并且不影响微生物的生长。为保证菌数测定结果能真实反映供试品中存活菌数的真实情况,对选定的菌数测定方法进行方法适用性确认,结果细菌计数可采用常规法联合中和法,真菌和酵母菌计数可采用常规法联合中和法。

4.2 抑菌剂剂量验证试验结果的分析 抑菌剂剂量验证试验中,得出将对羟基苯甲酸甲酯0.15 g/L和对羟基苯甲酸丙酯0.1 g/L混合加入五氯柳胺混悬液中作为抑菌剂,其对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有较强的灭菌作用,在第14天时,菌落数降为零；第28天时,细菌、真菌和酵母菌都会被完全灭杀。因为制剂中添加的抑菌剂都具有一定的毒性,为保证用药安全,制剂中添加的抑菌剂浓度应考虑调整至对动物不会造成副作用为宜。

4.3 抑菌效力测定结果的分析 由于五氯柳胺混悬液为瓶装制剂,容易在贮藏和使用过程中发生微生物污染,尤其是在治疗的过程中,容易被微生物污染[8-9]；但五氯柳胺混悬液中的有效成分五氯柳胺,本身具有一定的抑菌活性,与国外对于五氯柳胺抑制白色念珠菌和幽门螺旋杆菌[10-11]均有报道,并且对于其抗癌活性也有相关研究[12]的结果相符合。本试验按照《中国兽药典》2015年版“抑菌效力检查法”对其抑菌效力进行了测定,结果表明该产品符合《中国兽药典》要求,具有充分的抗菌效力,可避免在贮藏和使用过程中发生微生物污染。