时间分辨荧光免疫法检测梅毒螺旋体抗体的临床应用研究

赖玉玲 黄丽芳 雷 兴

1.广东省韶关市第一人民医院检验科，广东韶关 512000；2.广东省韶关市第一人民医院皮肤性病科，广东韶关 512000

梅毒（syphilis）是由苍白密螺旋体（treponema pallidum，TP）引起的细菌感染性疾病，人类是其唯一的传染源，传播方式主要是性接触，血液传播和垂直传播[1]。梅毒分期主要有一期，二期，三期和隐性梅毒。根据临床发现，一期和二期梅毒最具传染性。目前梅毒的诊断主要依靠实验室检测，尤其是血清学检查（主要有非特异性梅毒螺旋体抗体检测和特异性梅毒螺旋体抗体检测），但目前可用的检测手段不能区分性病梅毒与地方性螺旋体病，容易出现生物学假阳性甚至假阴性的结果[2-3]。随着医学检验技术的进步，时间分辨荧光免疫法（TRFIA）逐渐被用于临床多种疾病的检测当中，本课题旨在通过比较时间分辨荧光免疫法（TRFIA）与梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）在检测不同时期的梅毒的准确率，探讨评价时间分辨荧光免疫法（TRFIA）在梅毒血清学诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

严格按照梅毒诊断标准筛选，收集2018年1～8月在本医院门诊或住院接受治疗的100例梅毒干扰患者为研究对象，男67例，女33例，年龄19～55岁，平均（37.4±9.2）岁，其中一期梅毒19例，均有硬下疳；二期梅毒23例（11例表现为躯干丘疹、掌部铜红色脱屑性红斑；5例为外阴、肛周扁平湿疣；7例为脱发，色素减退斑、砺壳样痂屑）；三期梅毒10例；隐性梅毒48例。同时选取100例来我院体检的健康人作为健康对照组，男67例，女33例，年龄19～55岁，平均（35.3±4.1）岁。在征求研究对象的同意之后，签署《知情同意书》，对其梅毒检测情况进行回顾性分析。所有人员的平均年龄、病情程度、体质、意识清晰度及医生操作技术水平等方面基线资料，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入与排除标准[4-5]

纳入标准：诊断符合2014年我国疾病预防与控制中心《性传播疾病临床诊疗与防治指南》中梅毒的诊断：（1）疑似病例：同时符合（非梅毒螺旋体血清学试验阳性）和（既往无梅毒诊断与治疗史）项而无临床表现者；（2）确诊病例：同时符合疑似病例的要求和两类梅毒血清学试验均为阳性。排除标准：根据研究内容，排除以下三方面的的患者资料：（1）因门诊不能耐受治疗副反应而住院观察的首次治疗的梅毒患者；（2）入院后未行腰椎穿刺术无脑脊液检查结果的梅毒住院患者；（3）排除合并因外伤、炎症、免疫性疾病、HIV感染等引起脑脊液异常的患者以及近3个月内使用糖皮质激素或免疫抑制剂者。

1.3 仪器与试剂

时间分辨荧光免疫法（TRFIA）试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司，应用苏州新波EasyCuta全自动时间分辨荧光分析仪；梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）试剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社；梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司，应用深圳市汇松发展有限公司生产的MB-530多功能酶标分析仪和PW-960全自动酶标洗板机。

1.4 检测方法[6-7]

抽取相应患者静脉血4mL，常规离心分离出血清，分别依据时间分辨荧光免疫法（TRFIA）、梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）的试剂盒说明书并严格按照科室SOP文件进行操作，具体如下。

表1 三种检测方法检测结果比较[n（%）]

1.4.1 时间分辨荧光免疫法（TRFIA） （1）室温平衡板条5～10min；（2）微孔板底部加样本；（3）微孔板底部加生物素标记抗原；（4）室温孵育45min；（5）洗涤；（6）微孔板底部加EU标记链亲和素；（7）室温孵育 15min；（8）洗涤；（9）加增强液；（10）测量荧光计数值。阳性：标本S/CO值≥1。阴性：标本S/CO值＜1。

1.4.2 梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA） （1）室温平衡试剂盒5～10min；（2）于U型微量反应板，每份待测标本标记12个反应孔，第1孔加入100μL血清稀释液，第2～12孔各加入25μL血清稀释液；（3）取25μL待测血清加入第1孔中并充分混匀，吸取25μL加入第2孔，如上稀释，以此类推稀释至第12孔，最后弃去25μL；（4）在第3孔中加入25μL未致敏颗粒溶液，第4～12孔中各加入25μL致敏颗粒溶液；（5）微量振荡器上混匀30s；（6）加盖，室温静置2h；（7）观察结果，统计阳性率和阴性率。阳性反应：第3孔不出现凝集，第4孔开始出现凝集反应。阴性反应：第3孔、第4～12孔均不出现凝集反应。若第3孔出现凝集，实验无效，需重新检测。

1.4.3 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TPELISA） （1）室温平衡试剂盒 5 ～ 10min；（2）微孔板底部加样本；（3）37℃避光孵育60mim；（4）洗涤；（5）加酶结合物，继续避光孵育；（6）洗涤；（7）加底物显色剂，孵育10mim；（8）加终止液，酶标仪检测；（9）记录并判定结果。阳性：标本OD值大于或等于说明书中已设定阈值。阴性：标本OD值小于说明书中已设定阈值。

1.5 观察指标

观察健康对照组和各周期梅毒患者的TRFIA、TPPA、TP-ELISA的阳性百分率，比较梅毒患者的TRFIA、TPPA、TP-ELISA的诊断灵敏度、诊断特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及经济费用开支进行评价。

1.6 统计学方法

应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验：P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种检测方法检测结果比较

根据检测结果可知，与健康对照组相比：TRFIA、TPPA、TP-ELISA三种方法检测各周期梅毒患者的阳性百分率明显升高，说明三种方法均能较好的识别梅毒患者血清中相应抗体；但与TRFIA相比：TPPA、TP-ELISA法对一、二、三周期梅毒的阳性检出率有所下降、对隐性梅毒的阳性检出率显著下降，可以看出时间分辨荧光免疫法（TRFIA）的阳性检测具有更明显的效果，经χ2检验，TRFIA与TPPA的阳性检出率差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 三种检测方法的灵敏度、特异性分析

通过初步比较后得知，TRFIA法的阳性检测更具优势，需进一步确认其灵敏度和特异性：灵敏度=梅毒患者中阳性检测数／梅毒患者总例数×100%；特异性=健康对照组中阴性检测数／对照组总例数×100%；与TRFIA法比较，TPPA、TP-ELISA法灵敏度下降明显，差异有统计学意义（P＜0.01）；特异性差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 三种检测方法的灵敏度、特异性分析

2.3 三种检测方法的阳性、阴性预测值以及似然比分析

结合三种检测方法的灵敏度和特异性结果，进一步对其做阴阳性预测值、似然比的分析：阳性预测值=阳性检测结果中梅毒患者数／检测为阳性例数×100%；阴性预测值=阴性检测结果中健康例数／检测为阴性例数×100%。

阳性似然比=灵敏度／（1-特异性）；阴性似然比=（1-灵敏度）／特异性；与TRFIA法比较：TPPA法的阳性预测值有所增加，差异无统计学意义（P＞0.05）；但阴性预测值却显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），说明TPPA法虽有较高阳性检出率，但假阴性较高；与TRFIA法相比：TPELISA法的阳性预测值有所下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。但其阴性预测值显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01），提示其假阴性较高，且阳性检出率不如TRFIA法。结合似然比，与TRFIA法相比：TP-ELISA的阳性似然比值显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；TPPA、TP-ELISA法的阴性似然比虽然与TRFIA差异无统计学意义（P＞0.05），但均显著增加，提示其假阴性较高，即TRFIA的真阳性率和真阴性率均更高，诊断效果更好。见表3。

表3 三种检测方法的阳性、阴性预测值分析（%）

2.4 三种检测方法的经济费用评价

汇总三种检测方法假阴性导致复检的经济花费进行统计分析。可知，TRFIA检测法由于初检灵敏度高，假阴性率低，所以复检率低，费用较少；与TRFIA检测法相比，TPPA法复检率高，且费用较高，差异有统计学意义（P＜0.01）；TP-ELISA法由于单价较低，虽总体费用未超过TRFIA检测法，但因其灵敏度低，导致复检率高，需进行多次复检，给患者徒增负担。见表4。

表4 三种检测方法复检经济费用评价

3 讨论

梅毒、麻风和结核在过去医学并不发达的阶段被并列称为世界三大慢性传染病。其中梅毒因病程长、传染期长、症状时隐时现、多样复杂、有时临床表现很不典型，易误诊漏诊的特征而导致流行面广、危害严重[8]。一期梅毒又称早期梅毒，有感染史，潜伏期一般为2～3周，临床表现为硬下疳和腹股沟淋巴结肿大。二期梅毒为有感染史，可有一期梅毒史，病期2年以内[9]，临床表现为皮肤出现梅毒疹，口腔有黏膜斑，全身不适及浅表淋巴结肿大[10]。三期梅毒又称晚期梅毒，一般可有一期或二期梅毒史，病期2年以上，临床表现常见结节性皮疹、近关节结节及皮肤、黏膜、骨骼树胶肿等，心脏血管系统受累，以梅毒性脑膜炎、脊髓痨和麻痹性痴呆多见[11]。隐性梅毒有感染史，可有一期、二期或三期梅毒病史，但无任何梅毒性的临床症状和体征[12]。

目前梅毒的临床确诊，主要依靠实验室诊断作为依据，常用的实验室诊断方法有：病原体检验（暗视野显微镜检验DFM、梅毒螺旋体制动试验TPIT）；血清学检测-非密螺旋体抗原试验（快速血浆/血清反应素环状卡片试验RPR、甲苯胺红不加热血清反应素试验TRUST）；血清学检测-密螺旋体抗原试验（梅毒螺旋体荧光抗体吸收试验FTA-ABS、梅毒螺旋体-明胶凝集试验TPPA、梅毒螺旋体-酶联免疫吸附试验TP-ELISA、梅毒螺旋体-化学发光免疫分析CLIA）；基因检测（PCR技术、二聚体蝎型探针定量技术DSP）[13]。

常用的梅毒螺旋体-明胶凝集试验TPPA、梅毒螺旋体-酶联免疫吸附试验TP-ELISA法因其特异性低，临床上经常出现假阳性或漏检的现象[14]，因此探索一种新型，快速，受干扰少的检测方法十分有必要。时间分辨荧光免疫法TRFIA是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度，目前已经在临床中广泛用作多种病毒的实验室检测手段[15]。

本研究选取符合标准的患者，通过比较TRFIA、TPPA、TP-ELISA三种方法对不同时期的梅毒检测的阳性率，发现在无论是一期、二期、三期梅毒、还是隐性梅毒，TRFIA的阳性检测率均为最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析其灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值、阳性和阴性似然比，发现TRFIA的灵敏度最强，差异有统计学意义（P＜0.01），特异性虽无统计学意义，但结合似然比，当阳性似然比＞10或阴性似然比＜0.1时，诊断或排除某种疾病的可能性将显著增加，由此可知，TRFIA法的临床应用价值最高。

此外，通过对三种检测方法的经济评价，发现TRFIA法的复测率最低，相应花费较低，TPPA和TP-ELISA由于假阴性率高导致复检次数增加，给患者带来经济负担的同时，也对疾病的及时确诊和治疗造成了延误。

综上，可以判定时间分辨荧光免疫法TRFIA用于梅毒的实验室检测，具有灵敏度强，抗干扰度高的优势，在很大程度上能够降低假阳性和漏检的事件发生。