高效液相色谱法测定卡马西平9个杂质方法的评价

王 宇 陈运动 高 政

1.江苏天士力帝益药业有限公司，江苏淮安 223002；2.江苏慈星药业有限公司，江苏宿迁 223800

卡马西平（Carbamazepine）是抗癫痫的常用药物，是癫痫精神运动型发作和三叉神经痛的首选药物。在卡马西平的有关物质控制方面，中国药典与各国外药典均使用氰基色谱柱。在CP、USP与EP的色谱条件方法下，运用高效液相法检验时，卡马西平主峰与EP药典规定杂质A以及杂质B与杂质D之间的分离度达不到合格要求。参考文献[1-7]方法，现建立此有关物质的HPLC分析方法，对其验证，证明其方法专属性强，准确可靠。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

AUW120D型电子天平（日本岛津公司），SQP型电子天平（赛多利斯公司），安捷伦1260型高效液相色谱仪，沃特世2695/2998型高效液相色谱仪。

1.2 试剂试药

甲醇色谱纯（美国 TEDIA 公司，17125121），乙腈色谱纯（美国 TEDIA 公司，18035024），甲酸分析纯（上海苏懿化学试剂有限公司，20170203），三乙胺分析纯（国药集团，20160323），杂质A对照品（Lot：016326.0，含 量：99.98%，European），杂质 B对照品（Lot：AJ-028-24，含 量：99.22%，Aocs），杂 质 C 对 照 品（Lot：ESC-037-26，含 量：99.91%，Aocs），杂质 D 对照品（Lot：1205821，含量：98.76%，REFERENCE），杂 质 E对 照品（Lot：AJC-058-24，含量：99.83%，Aocs），杂 质 F对 照品（Lot：AJC-058-25，Aocs），杂质 G 对照品（Lot：AJC-118-25，含量：99.08%，Aocs），酰氯亚氨基二苄（Lot：2018051301，含量：99.64%，江苏慈星药业有限公司），卡马西平（Lot：Y201801003，江苏慈星药业有限公司）。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

流动相A：1000mL水中加三乙胺0.5mL甲酸0.5mL，混匀抽滤；流动相B：1000mL乙腈中加甲酸0.25mL，混匀，抽滤，按下述梯度条件测试。见表1。

检 测波 长：230nm，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，柱温：30℃；色谱柱：月旭XS-C18（4.6mm×250mm，5μm）。

表1 流动相梯度洗脱明细表

表2 降解试验物料平衡考察结果

2.2 测定法

溶液配制。供试品溶液：取本品适量，精密称定，用甲醇-水（1∶1）定容，制成0.5mg/mL。

对照溶液：取供试品溶液2～50mL容量瓶，加甲醇-水（1∶1）溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）稀释至刻度。

对照品储备液：取酰氯亚氨基二苄、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G对照品各20mg，精密称定，分别置100mL量瓶中，加甲醇50mL溶解后，用水稀释至刻度，分别制成每1mL中约含200μg的杂质储备溶液。

对照品定位溶液：分别精密移取杂质A、杂质E对照品储备液0.75mL，酰氯亚氨基二苄，、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G对照品储备液0.5mL，分别置100mL量瓶中用稀释剂定容。在分别移取5mL到10mL量瓶中用稀释剂定容（杂质A，杂质E为0.75μg/mL，酰氯亚氨基二苄、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G为0.5μg/mL）。

对照品混合溶液：分别精密移取杂质A、杂质E 对照品储备液0.75mL，酰氯亚氨基二苄、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G对照品储备液0.5mL，置同一100mL量瓶中用稀释剂定容。在移取5mL到10mL量瓶中用稀释剂定容。

系统适用性溶液：分别精密移取杂质A、杂质E对照品储备液0.75mL，酰氯亚氨基二苄、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F、杂质G对照品储备液0.5mL，供试品储备液25mL，置同一100mL量瓶中用稀释剂定容。在移取5mL到10mL量瓶中用稀释剂定容。

精密量取系统适用性溶液、对照品混合溶液、供试品溶液、对照溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中各杂质分离度要≥1.5，供试品溶液中如有与对照品溶液中杂质保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算。

2.3 专属性

分别取本品50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用溶剂甲醇-水（1∶1）稀释，在强碱、强酸、强氧化、高温条件下破坏后，室温放置24h；在光照条件下破坏5d进行强降解实验。同法制备相应破坏的空白溶液。精密量取各降解实验溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，报告溶剂对检测的干扰，报告系统适用性溶液中杂质的分离情况，计算物料平衡。试验结果表明溶剂不干扰其他杂质和主成份检测，对照品混合溶液中各杂质间分离度＞1.5。强制降解试验中主要降解产物的峰纯度合格，物料平衡在90%～110%之间。见表2、图1。

图1 分离度色谱图

2.4 检测限与定量限

精密量取检测限溶液和定量限溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。见表3。

表3 检测限、定量限结果（μg/mL）

2.5 线性范围

配制每1mL中各约含10μg的对照品储备液。取对照品储备溶液配制各杂质项下线性溶液，各精密量取20μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C（μg/mL）进行线性回归，得出各杂质的线性回归方程，线性范围。杂质A为0.5395～3.2370μg/mL（y=20.012x+0.794，r=0.9962，n=6），杂质 B 为 0.4985～ 2.9910μg/mL（y=60.679x+1.2167，r=0.9995，n=6），杂 质 C 为0.5075～ 3.0450μg/mL（y=67.349x-0.8307，r=0.9995，n=6），杂质 D 为 0.5080～ 3.0480μg/mL（y=89.659x-4.208，r=0.9999，n=6），杂 质 E为 0.5050～ 3.0300μg/mL（y=32.231x+3.8737，r=0.9973，n=6），杂质 F1为 0.4950～ 2.9700μg/mL（y=62.706x+0.7887，r=0.9998，n=6），杂 质 F2 为0.4950～ 2.9700μg/mL（y=14.772x+3.0857，r=0.9962，n=6），杂质 G 为 0.5180～ 3.1080μg/mL（y=61.868x+6.2873，r=0.9986，n=6）， 杂质酰氯亚氨基二苄为0.5080～3.0480μg/mL（y=32.855x+1.1273，r=0.9986，n=6），各杂质线性方程的相关系数R2≥0.990，y轴截距在100%响应值的25%以内，线性良好。

2.6 准确度

溶液配制：

对照品储备液1：用甲醇-水（1∶1）稀释，制成每1mL中含杂质A和杂质E各约10μg的对照品储备液。

对照品储备液2：用甲醇-水（1∶1）稀释，制成每1mL中各约含10μg的酰氯亚氨基二苄、杂质B、杂质C、杂质D、杂质F和杂质G对照品储备液。

样品溶液：取本品50mg，精密称定，置50mL量瓶中，精密称定，加甲醇25mL使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中约含卡马西平1mg的供试品溶液。

准确度溶液：取本品50mg，精密称定，置50mL量瓶中，按限度水平50%、100%、150%的相应浓度，精密量取杂质对照品储备液1和杂质对照品储备液2，分别加入各已有样品的量瓶中，加甲醇25mL使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。每浓度水平的准确度溶液平行配制3份。

测定：精密量取上述溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。分别计算各个浓度水平的单个和平均回收率和相对标准偏差，各浓度3份溶液中单个和平均回收率在90%～110%之间；相对标准偏差（RSD）≤10%。

2.7 精密度

重复性试验取准确度项下溶液，参考文献[8-11]方法，重复进样6次，各杂质对标准偏差（RSD）均≤8%。中间精密度试验为不同研究员，在不同日期，使用不同液相色谱仪，按重复性试验同法操作，各杂质相对标准偏差（RSD）均≤10%。

2.8 耐用性

取杂质储备液、对照品混合溶液和供试品溶液，对照溶液，于室温条件和冷藏条件下放置，参考文献[12-15]方法，在一定的时间间隔取样测定，计算杂质储备液、对照品混合溶液在不同稳定性时间点各峰面积，计算待测物质峰面积RSD，比较供试品溶液在各稳定性时间点的杂质检出情况。

改变色谱条件：与正常条件相比较，在改变色谱柱温度为 25℃、35℃、流速 0.9mL/min、流速1.1mL/min以及更换色谱柱条件下，考察供试品溶液中杂质的变化。对照品储备液、对照品溶液稳定性在相应稳定性时间点峰面积相对标准偏差（RSD）均≤5%，杂质＜0.2%，绝对差值在±0.05%，杂质检出个数没有差异。

3 讨论

通过对此卡马西平有关物质方法的验证，各项验证数据均符合中国药典标准规定，从而证明此方法在准确度、专属性、耐用性等方面表现良好。目前，各个国家药典中均选用氰基色谱柱，当氰基柱在使用四氢呋喃做流动相时，色谱柱的寿命很短，且长期使用柱效下降。其中，USP方法为超高效液相法，对仪器仪器与耗材要求严格，成本较高。而运用CP方法与EP方法高效液相检验时，卡马西平主峰与杂质A以及杂质B与杂质D之间的分离度达不到合格要求，不能实现所有杂质的分离，导致杂质限度检验不准确。此有关物质的HPLC检查方法，方法专属性强，准确可靠，建议中国药典采用此方法进行卡马西平有关物质检查。