老年心力衰竭患者外周血miR-423-5p表达水平及与心室重构的关系探讨

张洪，薛蕾，王喜欢

心血管疾病是威胁我国国民生命健康的最主要的公共卫生安全问题，大大增加了社会的医疗负担。大多数心血管疾病最终都会演变至心力衰竭（HF），尤其以冠状动脉（冠脉）粥样硬化性心脏病（冠心病）为主。HF是由于心肌收缩和/舒张功能障碍，心输出量无法满足机体需求，引发一系列复杂的临床综合征，是患者致残甚至死亡的主要原因[1]。HF患者最初表现为左心室几何形状及结构改变，并伴有心肌细胞肥大、心肌代偿性肥厚，最终发生心力衰竭[2]。因此心室重构是HF发生和进展式演变的主要病理机制之一，HF必然全程伴随着心室重构[3]。如何准确判断心室重构进程，提供比影像学更丰富的信息是心血管疾病治疗领域一直积极探索的难题。目前临床上很多用于HF诊断和危险分层的生化标志物的敏感性较低，近几年随着医疗观念的转变，对于心血管疾病的治疗已逐渐由“重治疗”转向“重预防”[4]，因此寻找敏感的预警标志物，用以筛选HF的高危人群成为当代医学关注的重点。相比之下，对于已发生心室重构但无HF临床表现的HF人群尽早给予合理干预并逆转心室重构更具有现实的临床价值。循环miRNAs因其具有较高的稳定性和特异性，且分离、检测操作简单易行，逐渐凸显出其在心血管疾病诊断和治疗领域的潜力和优势[5]。考虑到超声心动图的费用较高，寻找更敏感的miRNAs成为更具吸引力的研究方向。笔者在前期研究中发现，与健康人群比较，终末期HF患者外周血miR-423-5p表达上调，是否可作为早期HF高危患者的筛查指标以及与心室重构的关系是本项研究探讨的重点。现研究报告如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2016年2月至2018年4月于南阳市第二人民医院心内科确诊并接受治疗的老年（≥60岁[6]）HF患者187例，其中男性103例，女性84例，年龄为60～84岁，平均年龄为（68.75±7.32）岁。所有患者均接受心脏超声、实验室检查和选择性冠状动脉造影（CAG）检查。根据美国心脏学会（ACC）/美国心脏病协会（AHA）关于心衰分期标准[7]，91例为心衰A期（A组），96例为心衰B期（B组）。另外选择同时期在我院体检中心进行体格检查的正常受试者（C组）46例作为对照组，其中男性26例，女性20例，年龄60～81岁，平均年龄为（70.18±6.54）岁。本项研究已获得伦理委员会的审查批准。

1.2 诊断标准、纳入和排除标准

1.2.1 ACC/AHA心衰分期A期：具有高血压、糖尿病、高脂血症等心衰危险因素，但未出现心室肥大、心功能损伤或心室几何结构变化；B期：已出现心室肥大、心功能损伤或心室几何结构变化，但从未表现出心衰的症状和体征；C期：出现胸痛或胸部不适等症状，经心电图检查出现缺血性ST-T异常和病理性Q波，经心脏超声检查出现左室肥大和/或左室几何构型改变，既往无明确心律失常、心室重构、心动过速、房室传导阻滞等心衰指征；D期：难治性心衰。

1.2.2 纳入标准①符合ACC/AHA心衰分期A期或B期的诊断标准；②C组受试者：经常规体格检查证实无心血管危险因素、且无心脏结构改变。以上受试对象年龄≥60岁，受试者或家属签署知情同意书。

1.2.3 排除标准①不符合上述纳入标准的患者；②受试前3个月出现严重的意识障碍、高血压危象、心衰急性失代偿临床表现者；③合并先天性心脏病、心肌炎、风湿性心脏病、免疫系统疾病、血液系统疾病、急慢性严重感染、肝肾功能损伤、恶性肿瘤、严重出血倾向者；④既往接受冠脉搭桥术或冠脉支架植入术者。

1.3 研究方法

1.3.1 血液样本采集所有受试者禁食12 h后，次日清晨，取肘静脉血，加入枸橼酸钠抗凝，4 ℃ 3000rpm离心10 min，分离血浆，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 实验室生化指标检查采用DXC800全自动生化分析仪（美国Beckman公司）进行检血常规测。严格按照仪器操作手册进行操作，所有检测在2 h内完成。包括糖化血红蛋白（HbAlc）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等生化指标。

1.3.3 qRT-PCR法检测外周血miR-423-5p①提取外周血总RNA。采用凝胶电泳检测RNA分子量；采用分光光度计检测RNA浓度。②RNA逆转录：根据Taqman® MicroRNA reverse transcription kit和Taqman® MicroRNA assay kit试剂盒（日本Takara公司）说明书操作进行。将cDNA保存至-20 ℃保存备用。③实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）：按照三步法进行PCR扩增。以组织cDNA为模板，以β-actin作为内参，将20 μl反应体系置于37 ℃恒温水浴60 min，85 ℃ 5 s，加入去离子水至100 μl，各反应孔取2 ul进行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反应体系，95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环45次。根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR结果判断：根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。

1.3.4 心脏超声相关指标患者在静息状态下，由超声专业人员采用iE33超声心动图仪（荷兰Philips公司）进行超声心动图检查，包括左室舒张末径（LVEDD）、舒张末室间隔厚度（IVSD）、舒张末左室后壁厚度（PWD）。左室质量（LVM）=1.04×[（LVEDD+IVSD+PWD）3-LVEDD3]-14；左室质量指数（LVMI）=LVM/体表面积；左室相对室壁厚度（RWT）=（IVSD+PWD）/LVEDD。根据2013年欧洲高血压指南[8]推荐关于左室肥厚的标准，LVMI≥124 g/m2（男），LVMI≥110 g/m2（女）。

1.4 统计学处理本资料采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理。所有变量均进行正态检验，正态变量以平均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分率（%）表示，组间比较用χ2检验。对连续变量采用Spearman秩相关检验；采用多元Logistic回归模型分析心室重构的影响因素。采用受试者工作特征（ROC）曲线确定miR-423-5p对前心衰患者的筛选价值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般临床资料比较三组受试者年龄、体质指数、吸烟史和饮酒史基本一致，未见统计学差异（P＞0.05）。另外，除了NYHA心功能分级以外，A组和B组患者一般临床资料基本一致，未见统计学差异（P＞0.05），具有可比性。由于分组原因，A组患者NYHA心功能分级Ⅱ级比例高于B组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 研究对象外周血miR-423-5p水平比较A组、B组和C组三组受试者外周血miR-423-5p相对表达量分别为（1.22±0.19）、（1.86±0.24）、（0.47±0.12），其中C组受试者外周血miR-423-5p相对表达量明显低于A组和B组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时B组患者外周血miR-423-5p相对表达量明显高于A组患者，差异也具有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.3 ROC曲线分析miR-423-5p对心室重构的诊断价值为进一步分析miR-423-5p是否可用于从无症状人群中筛选出心衰B期患者，笔者采用ROC曲线分析，在B组和C组共142例中评价miR-423-5p对心衰B期患者的诊断效能。经ROC曲线分析，曲线下的面积为0.721（95%CI：0.634～0.797），截断值为1.27。提示外周血miR-423-5p水平于筛选心衰B期患者有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

2.4 HF患者血液生化指标和心功能指标比较比较A组和B组患者血液生化指标和心功能指标，结果显示，两组患者FPG、2hPG、HbAlc、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平基本一致，无统计学差异（P＞0.05）。但是B组患者LVEDD、IVSD、PWD、LVMI和RWT心功能指标明显高于A组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表1 三组受试者的一般临床资料分析

图1 研究对象外周血miR-423-5p相对表达量柱状图（与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05）

图2 miR-423-5p筛选前心衰患者的ROC曲线图

2.4 多元Logistic回归分析影响LVMI的独立危险因素以心室重构（1表示心衰B期，0表示心衰A期）作为因变量，采用多元Logistic回归分析表1和表2中A组和B组之间存在统计学差异的变量，包括NYHA心功能分级、LVEDD、IVSD、PWD、LVMI、RWT等心功能指标以及miR-423-5p水平，结果显示，NYHA心功能分级、LVEDD、IVSD、PWD、LVMI、RWT等心功能指标以及miR-423-5p水平和心室重构关系密切（P＜0.05）（表3）。

3 讨论

心力衰竭是由心肌损伤引起的一系列血流动力学障碍综合征，尤其是慢性心力衰竭是心肌梗死、心肌炎等大多数心血管疾病的终末期表现，患者预后较差，增加了医疗负担。随着我国老龄化进程的加快，加之环境因素的影响和生活工作压力的增大，冠心病的发病率逐年增加，其慢性并发症也逐渐成为威胁人类健康的主要原因之一[9]。心力衰竭是心血管疾病的终末阶段，是导致冠心病患者心源性猝死的最直接原因。根据ACC/AHA心衰指南，可将心衰患者分为4期，包括只有心血管疾病危险因素而未出现心室重构的A期患者，已发生心室重构而未出现心衰症状的B期患者，已出现心衰症状和体征的C期患者以及难治性终末期心衰患者即D期患者[10]。该分期反映了心衰演变过程，相较于纽约心脏协会（NYHA）关于心功能的分级标准，对于识别心衰高危患者更具有临床价值。

表2 两组患者血糖和血脂比较（±s）

表2 两组患者血糖和血脂比较（±s）

注：FPG：空腹血糖；2 hPG：2 h血糖；HbAlc：糖化血红蛋白；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；LVEDD：左室舒张末径；IVSD：舒张末室间隔厚度；PWD：舒张末左室后壁厚度；LVMI：左室质量指数；RWT：左室相对室壁厚度

项目 A组（n=9 1） B组（n=9 6） t值 P值F P G（m m o l/L） 6.7 3±1.1 8 6.9 2±1.2 7 1.0 5 8 0.2 9 1 2 h P G（m m o l/L） 8.4 8±1.7 4 8.6 3±1.4 9 0.6 3 4 0.5 2 7 H b A l c（%） 6.5 8±0.9 4 6.6 7±0.7 9 0.7 1 0 0.4 7 9 T C（m m o l/L） 4.8 1±0.5 7 4.8 6±0.7 3 0.5 2 0 0.6 0 4 T G（m m o l/L） 1.5 4±0.2 3 1.5 6±0.1 9 0.6 5 0 0.5 1 7 H D L-C（m m o l/L） 2.2 7±0.7 5 2.3 0±0.6 8 0.2 8 7 0.7 7 5 L D L-C（m m o l/L） 3.3 9±0.2 8 3.3 1±0.3 4 1.7 5 1 0.0 8 2 L V E D D（m m） 4 8.7 2±6.9 8 5 4.8 3±7.5 2 5.7 5 0 0.0 0 0 I V S D（c m） 0.9 9±0.1 1 1.1 3±0.1 5 7.2 4 6 0.0 0 0 P W D（c m） 0.8 7±0.1 0 1.0 5±0.1 3 1 0.5 7 2 0.0 0 0 L V M I（g/m 2） 9 7.8 2±1 9.8 6 1 4 7.2 6±2 1.3 7 1 6.3 6 5 0.0 0 0 R W T 0.4 0±0.0 3 0.5 2±0.0 5 1 9.7 6 7 0.0 0 0

表3 多元Logistic回归分析miR-423-5p及其它因素与心室重构的关系

目前临床上主要依靠心脏彩色多普勒超声检查作为心室重构最主要的诊断手段，但是由于心室重构早期表现并不明显，采用心脏彩超进行人群随访效价比低且受心脏瓣膜返流等因素影响，易导致漏诊[11]，因此，寻找敏感、便捷、快速的血清学检测指标对于心室重构的早期诊断具有重要的临床意义。自十年前，有学者提出循环血中miRNAs检测可用于癌症的诊断和预后评估以来，越来越多的专家开始关注miRNAs作为心血管疾病诊断分子的可能[12]。miRNAs是存在于真核细胞内的小分子非编码RNA，与人类1/3以上的基因调控都密切相关[13]。但是医学界关于miRNAs的研究刚刚起步，大多数的miRNAs尚处于未知领域。本项研究的分组设计参考了ACC/AHA分期标准，旨在分析新发现的miR-423-5p在心衰早期阶段的血清水平以及变化趋势，并探讨是否可作为筛选心衰高危患者的辅助指标。所以本项研究并未探讨C期和D期HF患者。

目前，众多学者认为血清标志物对于筛查心衰患者所提供的信息以及指导早期干预价值有限[14]，因此从筛查无心衰症状的B期患者入手，以降低C期患者的发生率具有重要的现实价值。本项研究结果发现，相较于A组和C组受试者，B组患者外周血miR-423-5p水平最高，说明，随着HF的演变和进展，miR-423-5p水平逐渐升高，可能参与心室重构过程。最初由Nabialek发现miR-423-5p与急性心肌梗死有关[15]；随后，Tijsen证实心衰患者循环血中miR-423-5p显著高于健康人群，提示miR-423-5p可作为心力衰竭诊断的标志分子[16]。而且也有基础研究显示高压诱导的心力衰竭大鼠外周血miR-423-5p表达水平明显高于正常对照组，且推测miR-423-5p可能来源于受损的心肌细胞[17]，但是具体的作用机制仍然后续需要深入研究，因此miR-423-5p是否能够反映心室重构状态未见相关研究。

为了进一步探讨miR-423-5p与心室重构的关系，因此选择A期和B期患者作为研究对象，并且经Spearman相关性分析证实miR-423-5p与LVEDD、IVSD、PWD、LVMI和RWT呈正相关性，并且经多元线性回归分析显示，miR-423-5p可能是心室重构的独立预测因子。虽然证实miR-423-5p可作为筛选前心衰患者的标志分子，但是本项研究仍然存在一定的局限性，医师纳入样本量有限，未进行风险分层分析，二是采取横断面研究设计，无法反应外周血中miR-423-5p的动态变化，因此，尽管得出的结论证实miR-423-5p与心室重构有关，但是无法得出因果结论。miR-423-5p水平升高可能是由于心室重构引起的，也可能是引起心室重构的重要原因，因此尚需后续进一步研究证实。

综上所述，外周血miR-423-5p水平可反应心力衰竭早期动态演变过程，可作为从社区老年人群筛查心力衰竭高危患者的辅助指标，在心血管疾病的二级预防中具有重要的指导价值。此外，miR-423-5p与心室重构呈独立、显著的正相关性，可作为老年慢性心力衰竭患者发生心室重构的诊断因子。但我们纳入的样本有限，且本项研究属于横断面研究设计，不能反映miR-423-5p在心力衰竭不同进展阶段的动态变化，因此需要大样本前瞻性研究以进一步证实miR-423-5p在心力衰竭患者心室重构过程中的重要作用。