107例泛发性脓疱型银屑病IL36RN基因突变检测及基因型-临床表型相关性分析

李璐璐 付希安 王真真 于功奇 刘 红 张福仁

泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis, GPP)是一种泛发的、反复发作的系统性炎症性皮肤病。该病常伴有白细胞和C反应蛋白升高等，严重者可并发内脏器官损害，甚至危及生命。该病的病因和发病机制尚未完全明确，研究已经证实遗传因素在疾病的发生、发展中发挥重要作用[1]。最早，Marrakchi等[2]提出白介素36受体拮抗基因(interleukin36 receptor antagonist gene，IL36RN)突变与家族性GPP的发病相关，IL36RN突变引起的白细胞介素36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist，IL36Ra)活性降低(deficiency of interleukin thirtysixreceptor antagonist, DITRA)可能是引起泛发性脓疱型银屑病(GPP)无菌性脓疱产生的重要原因。根据病程的发展过程中是否出现寻常型银屑病(PV)，GPP可分为合并PV的GPP及单纯型GPP。我们及其他团队研究表明IL36RN基因的突变率在单纯型GPP中明显高于合并PV的GPP组，从遗传学角度解释了单纯型GPP是区别于合并PV的GPP一种GPP类型[3,4]。另外有研究表示，IL36RN突变基因型与GPP患者的临床表型及病情的严重程度有一定关联[5-7]。

本研究拟通过对107例中国汉族人群GPP进行IL36RN直接测序，并对其进行基因型-临床表型分析，以探讨该基因与GPP临床表型的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究招募了107例我院2014年1月至2017年1月住院的GPP患者。由我院超过2名有经验的皮肤科医师诊断。所有的患者表现为原有银屑病斑片或弥漫性红斑基础上脓疱，多数患者出现高热、中性粒细胞及C反应蛋白升高。组织病理学可见典型的表皮中性粒细胞浸润形成Kogoj海绵状脓疱。依据《赫尔辛基宣言》的原则，本研究得到了山东省皮肤病医院伦理委员会的批准。所有患者已签署知情同意书。

本研究采用统一设计的GPP遗传流行病学调查问卷，内容包括一般情况(姓名、年龄、性别、民族、住址等)、GPP发病年龄、PV发病年龄(合并PV患者)、诱发因素、银屑病家族史。检查结果包括体温、血常规、C反应蛋白、血沉。选取所有结果记录值中的最高值。

1.2 方法

1.2.1 样本准备 收集107例中国汉族GPP患者肘静脉外周血，提取基因组DNA(QuickGene DNA whole blood kit L, KURABO公司,日本)。利用全波长紫外线分光光度计ND-8000(NanoDrop公司，上海)测定基因组DNA纯度及浓度。将DNA原液标化至96孔板中，模板DNA浓度为30 ng/μL。

1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增及DNA测序 扩增IL36RN基因(参考号NM_012275.2)的全部4个编码的外显子及其侧翼序列。引物序列见表1。PCR采用12.5 μL体系：Taq master Mix(包含dNTP、Taq酶和缓冲液)6.5 μL,灭活的去离子水ddH2O 5 μL,上下游引物(F+R)各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL。PCR反应条件：预变性95℃ 10 min；进行以下35个循环:变性95℃ 40 s,退火(退火温度见表1)30 s，延伸72℃ 1 min；最后延伸72℃ 10 min。利用ABI 3500XL基因测序仪(Applied Biosystems，美国)测序。将测序结果和参考序列同时输入到NCBI/BLAST中比对分析。

1.2.3 统计学方法 所有数据采用SPSS软件包22.0版本处理。除了描述性数据，定量资料以均数(标准差)或百分比(频率)表示。携带或不携带IL36RN基因突变的患者临床表型两组间的差异比较，采用两独立样本T检验或非参数检验。定性资料采用Pearson’s卡方检验或Fisher’s精确检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 107例GPP患者中包括31例单纯型GPP患者和76例合并PV的GPP患者，包括31例儿童型GPP患者和76例成人型GPP患者，GPP患者及各亚组患者的年龄、性别比例、发病年龄等基本情况如表1所示。

表1 107例GPP患者的基本资料

注：GPP，泛发性脓疱型银屑病；PV，寻常型银屑病；GPP + PV，GPP发病之前、之后或同时出现的寻常型银屑病症状；成人型GPP，GPP发病年龄≥18岁；儿童型GPP，GPP发病年龄<18岁

2.2 IL36RN基因突变分析 对107例GPP患者进行IL36RN基因测序，共检测到9个非同义突变位点，总结见表2。

我们的研究中，共发现了3个新发突变位点p.Arg10Gln, p.Leu78Pro和p.Tyr89X。突变点p.Tyr89X为终止错义突变位点，在1例单纯型GPP患者中检测到。应用基因突变致病性预测工具对新发现的错义突变点p.Arg10Gln和p.Leu78Pro进行功能预测，PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml)将2者归类为有害；SortingIntolerant From Tolerant(SIFT)(http://sift.bii.a-star.edu.sg)将突变点p.Arg10Gln预测为无害，将突变点p.Leu78Pro预测为有害。

2.2.1 IL36RN基因型-GPP临床表型关联性分析 根据基因型将107例GPP患者分为三种亚型：A. 不携带IL36RN基因突变的GPP患者(62例)，B. 携带杂合IL36RN基因突变的GPP患者(20例)，C. 携带隐性IL36RN基因突变(纯合突变或复合杂合突变，即含2个或2个以上突变等位基因)的GPP患者(25例)。所有GPP患者的临床流行病学特点见表2，利用2×2四格表χ2检验和Fisher’s精确检验的分析方法分别比较不携带IL36RN基因突变的GPP组(A)与携带IL36RN基因突变的GPP组(B + C)，携带杂合IL36RN基因突变组(B)与携带隐性IL36RN基因突变组(C)的IL36RN基因型-临床表型之间的关联性，详细分析见表3。

表2 107例患者IL36RN突变点总结

表3 所有GPP患者的临床表型与IL36RN基因型关联特点

本研究属于单中心研究，所有GPP患者皆来自山东省或周边地区。107例GPP患者的平均年龄为(35.31±18.05)岁，男性多发，男女比例为1.28：1。统计分析发现携带或不携带IL36RN基因突变组(A vs. B+C)、携带杂合或隐性IL36RN基因突变组(B vs. C)患者的年龄、性别分布无差别(P>0.05)。107例GPP患者最常见的诱发因素为上呼吸道感染，占所有患者的32.7%(35/107)，其余诱发因素包括季节改变、妊娠、暴晒、外伤、手术、药物等，但伴发诱发因素与否与GPP患者是否携带IL36RN基因突变无关。107例GPP患者中只有20.6%的患者有明确的银屑病家族史，且与GPP患者是否携带IL36RN基因突变无关(P>0.05)。107例GPP患者的平均GPP发病年龄为(31.31±18.59)岁，统计分析结果显示，其在携带IL36RN基因突变的GPP患者(27.8±20.31)岁明显低于不携带突变的患者(34.51±17.43)岁(P=0.028)；其在携带隐性突变GPP患者(17.92±9.17)岁虽然低于携带杂合突变的GPP患者(30.67±21.3)岁，但差异并无统计学意义(P=0.056)。大部分GPP患者发病前或发病过程中曾出现PV症状，携带IL36RN基因突变的GPP患者合并PV的概率明显低于不携带突变的GPP患者(57.8% vs. 80.6%,P=0.010)，但携带隐性突变或携带杂合突变的GPP患者合并PV的概率无明显差异(70% vs. 48%,P=0.138)。接近50%的GPP患者病情曾反复发作(发作>2次)，统计分析发现携带IL36RN基因突变的患者比不携带基因突变的患者更易再次发作(62.2% vs. 38.7%,P=0.016)，且携带隐性突变患者的再次发病率明显高于携带杂合突变患者(84% vs. 35%,P=0.001)。大部分的GPP患者都曾伴发系统性炎症(体温>38℃，白细胞计数>12×109/L)，但携带或不携带IL36RN基因突变与GPP患者是否伴发系统性炎症无关(P=0.333)，而携带隐性突变患者系统性炎症发生率明显高于携带杂合突变患者(100% vs. 50%,P=6.10E-05)。

3 讨论

IL36RN编码一种可溶性分子白细胞介素36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist，IL36Ra)，主要表达于皮肤角质形成细胞。IL36Ra通过拮抗IL36相关炎症因子的生物学效应，从而抑制炎症反应的加重。IL36是白介素-1家族的主要成员之一，该家族主要包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ等11个成员[12,13]。小鼠的IL1F5与人类的IL36RN直接同源，当将小鼠的IL1F5基因敲除后，小鼠皮肤炎症反应的基础上脓疱发作，类似于人类的GPP[14]，证实了IL36RN是引起GPP发病的一个致病基因。2011年，Marrakchi等[2]在9个突尼斯家族性GPP家族中检测到IL36RN基因p.Leu27Pro纯合突变，并提出家族性GPP倾向于常染色体隐性遗传。随后，多个学者在多例散发GPP患者中检测到IL36RN基因突变，并研究发现IL36RN基因突变引起导致DITRA，炎症信号通路激活最终导致GPP的发生[11,15-17]。迄今为止，在亚洲、欧洲、非洲种群中，共发现20余个IL36RN基因突变与GPP的发病相关[2,7-11,15,17-19]其中突变点c.115+6T>C在亚洲GPP患者中突变率最高，突变点p.Ser113Leu在欧洲种群中突变率最高。

本研究发现了3个未报道的错义突变位点，即p.Arg10Gln，p.Leu78Pro和p.Tyr89X。其中突变点p.Tyr89X在1例单纯型GPP患者中被检测到，这例患者曾多次发病，病情较重，药物可诱发发病，曾被误诊为急性泛发性发疹型脓疱病，我们认为该患者病情可能与此致病突变有关。突变点p.Arg10Gln和p.Leu78Pro被蛋白功能预测软件PolyPhen2认定为可致破环性错义突变位点。因此我们认为以上突变点具有潜在的致病能力，而其最终导致DITRA的具体机制仍有待进一步研究。值得注意的是，我们发现2例GPP患者同时携带三个IL36RN基因杂合突变，这是迄今为止发现的最多的突变个数。

多个研究结果显示，隐性IL36RN基因突变(纯合或复合IL36RN基因突变)与GPP的发病相关[2,11,20]。2015年，Hussain等[5]分析233例GPP患者的IL36RN基因型与GPP临床表型的关联，发现携带IL36RN基因突变患者较不携带IL36RN基因突变患者的GPP发病年龄更低，更易患系统性炎症，发病前或发病过程中发生PV的概率更低。而携带IL36RN基因隐性突变的患者较携带IL36RN基因杂合突变的患者平均发病年龄更低，但伴发系统性炎症的概率相比无统计学差异。随后，Wang等[7]通过对66例中国种群儿童单纯型GPP进行IL36RN直接测序，分析IL36RN基因型与GPP临床表型的关联发现，IL36RN基因突变型与GPP的发病年龄、次要炎症皮损征象(融合的脓湖、肛周糜烂、皱襞糜烂)、口服低剂量阿维A治疗后复发率等临床表型有关。另外，Mössner等[6]通过对66例欧洲种群的GPP患者进行IL36RN基因测序，分析其基因型-临床表型关联性发现IL36RN基因隐性突变型与GPP的发病年龄临床表现相关，但IL36RN基因突变与GPP的发病年龄无明显相关性。基于以上研究结论各有不同，在此我们对107例中国汉族GPP进行IL36RN基因型与GPP临床表型关联性分析，认为IL36RN基因突变型与GPP患者的发病年龄、合并PV症状的概率、疾病反复发作的概率相关，而IL36RN基因隐性突变型与疾病反复发作的概率、疾病合并系统性炎症的概率相关，由此我们有理由认为IL36RN基因突变与GPP患者的临床表型存在一定关系，而携带IL36RN隐性突变的患者具有更严重的临床表型。

综上所述，IL36RN基因突变不仅与GPP的发病相关，与GPP的临床表型也相关。