土壤中烟草根黑腐病菌的real-time PCR分子检测

许大凤，叶磊，张丽娜，韩永镜，周本国，檀根甲

1 安徽省农业科学院烟草研究所，安徽 合肥 230031；

2 安徽农业大学，安徽 合肥 230036；

3 安徽省烟草公司，安徽 合肥 230022

烟草根黑腐病是由根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）侵染引起的土传真菌病害[1]，在我国河南、山东、云南、安徽和贵州等烟区均有发生，对烟叶生产危害极大[2]。烟草根黑腐病主要在根部出现坏死[3]，通常与烟草根腐病、烟草黒胫病等病害混合发生，由于这些病害的症状相似，仅凭症状难以准确鉴定[3-4]，土壤中烟草根黑腐病菌除了用选择培养基、普通PCR[5]鉴定外，康振辉[6]等应用实时定量PCR（real -time PCR）对该菌在土壤中的检测方法进行了研究。本试验针对烟草根黑腐菌与其它真菌的ITS序列差异，设计了一对特异性引物TbF/TbR，建立了针对烟草根黑腐菌的real-time PCR检测方法，对田间土壤中烟草根黑腐病菌孢子量进行定量检测，为烟草根黑腐病的早期诊断和有效防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌培养和基因组DNA提取

试验所用的烟草根黑腐病菌株分离自皖南烟区发病植株，烟草黑胫病菌株、烟草根腐病菌株、小麦赤霉病菌株、油菜菌核病菌株和水稻纹枯病菌株均由安徽农业大学植物保护学院实验室提供。转接的菌株平板培养7 d后，收集菌丝，采用CTAB法提取其基因组DNA。

1.2 特异性引物的设计

依据GenBank中登录的烟草根黑腐病菌及其近缘菌株rDNA的ITS区的序列差异，多重比对后设计烟草黑腐病菌特异引物TbF/TbR（TbF：5'-TCAT CGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCT-3'，TbR：5'-CAGGGAAGCTGTATATACAACAGCCGATG-3'），引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.3 引物特异性验证

选取以烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、烟草根腐病（Fusarium oxysporum）、小麦赤霉（Fusarium graminearum）、油菜菌核（Sclerotinia sclerotiorum）、水稻纹枯病（Rhizoctonia solani ）等田间土传病害的病原菌来检测引物特异性。各取浓度为50 ng/μL的DNA模板，参照康为世纪公司的2xEs Taq MasterMix（Dye）说明书进行PCR反应，反应结果进行凝胶电泳检测，有条带的产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，验证引物的特异性。

1.4 引物real-time PCR的灵敏度检测

将分离纯化后到的烟草根黑腐菌用0.5%的吐温20水溶液冲洗培养基，收集孢子悬液，显微镜下用血细胞计数板计算浓度后，再用0.5%的吐温20水溶液稀释成浓度为1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL、1×102个/mL和10个/mL的孢子悬液。分别取不同浓度的孢子悬浮液加入直径为3 mm、5 mm的钢珠和0.3 g 的酸洗玻璃珠在研磨器中65HZ，震荡1 min进行破壁反应，再通过CTAB法提取DNA作为模板，无菌水作空白对照，每个反应的模板取1 μL，以康振辉等[6]设计 的 引 物Tb5/Tb6（5'-TATTCATTGCTGAGTGGC -3'/5'-GGTTTTCCGGCATGTTAT- 3'）和本试验设计的引物TbF/TbR，参照TaKaRa SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）说明书。进行real-time PCR扩增，每个处理3个重复。

1.5 检测土壤中烟草根黑腐菌的real-time PCR反应和标准曲线的建立

采集皖南烟区多年未种植烟草的田块土壤，清理杂物并灭菌烘干。将分离纯化后的烟草根黑腐菌的孢子制成悬液经显微镜观察计数后，稀释并接种到土样中，使土壤中烟草根黑腐菌分生孢子浓度为每克土壤106、105、104、103、102、10个孢子，作为不同浓度梯度的土样，采用康为世纪公司Soil Genomic DNA Kit试剂盒提取土壤样品总DNA，每个土样做三次重复，对照用未接种的土样。

1.6 烟草土壤取样及烟草根黑腐病调查

土壤样品采集于皖南烟区，在宣城市黄渡乡选取五块烟田，烟田起垄后烟苗移栽前采用五点采样法取样，每个田块按X形布点在田垄上采样,取样时去掉表层土，在5～20 cm土层深度，每点取样200 g左右，装袋密封带回实验室。本次共取25个样品，每个样品放室内晾干后采用四分法，康为世纪公司Soil Genomic DNA Kit试剂盒提取各土壤样品总DNA，进行real-time PCR反应，每个样品重复3次。

五月份烟株旺长期，对五块烟田进行烟草根黑腐病发病率调查，每块烟田随机调查1000株。

1.7 数据统计分析

试验数据用SPSS 20.0软件进行显著性差异（LSD）统计分析。

2 结果与分析

2.1 引物特异性验证

依据GenBank中登录根串珠霉属（Thielaviopsis basicola）及其近缘菌株rDNA的ITS区的序列差异，利用软件MegAlign、PrimerPremier 5.0、Oligo 6.0相结合设计一对特异性引物TbF/TbR。进行PCR扩增反应，从图1中看到，只有第1泳道有一条独立且清晰的150 bp左右的条带，其它供试菌株和清水对照均没有扩增产物，对第1泳道对应的产物进行测序，测序结果用DNA STAR软件分析序列，比对结果与T.basicola的ITS序列100%相似，说明引物具有较强的特异性。

图1 引物TbF/TbR的特异性验证Fig.1 The specific amplification of Thielaviopsis basicola by primer pair TbF/TbR

由图2 TbF/TbR和 Tb5/Tb6引物的Real-time PCR反应结果中可以看出，左图中曲线2比曲线1进入平台期的循环数低，说明曲线2扩增效率明显高于曲线1。在右图中，曲线1和曲线2在87.06℃时出现最大峰，但是曲线1出现多峰，87.06℃也有明显的峰值，说明曲线2的引物特异性更强，real-time PCR的结果更加可靠。

图2 引物Tb5/Tb6和TbF/TbR Real-timePCR反应结果Fig.2 The Ct curve and melt curve of real-time PCR detection using Tb5/Tb6 and TbF/TbR as primers

表1 各浓度T.basicola分生孢子的real-time PCR反应结果Tab.1 Results of real-time PCR of different concentrations of T.basicola conidia

2.2 引物灵敏度检测

以10倍浓度梯度的根黑腐菌孢子提取的DNA作为模板，进行real-time PCR扩增反应，结果如表1所示：用TbF/TbR进行real-time PCR反应，检测的烟草根黑腐菌模板DNA下限在1.74 ng/μL。

2.3 不同浓度梯度接种的土样实时定量PCR结果和标准曲线建立

在烟草根黑腐菌不同浓度孢子的土样中，取0.1 g提取DNA作模板，每个土样取3次重复，以未接菌的土壤为空白对照，进行real-time PCR反应得到CT值，结果如表2所示，各浓度孢子的土壤real-time PCR扩增曲线如图3所示。结果表明，所有接种的土壤都有CT值，最后的溶解曲线都是单一的峰值，且溶解温度为84.87℃（图4）。由表中反应的CT值和土壤孢子量，可以计算出每个反应体系中分生孢子数目的对数(X)和对应的ct值(Y)之间呈线性关系，即SYBR Green qPCR标准曲线：y = -1.5206x + 24.919，如图5。

图3 不同孢子浓度土样的real-time PCR扩增曲线Fig.3 The real-time PCR amplification curve of soil samples with different concentrations of spore

图4 不同孢子浓度土样的real-time PCR溶解曲线Fig.4 The real-time PCR melt curves of soil samples with different concentrations of spore

2.4 土壤检测结果

图5 10倍浓度梯度根黑腐菌孢子接种土样的real-time PCR标准曲线Fig.5 The real-time PCR standard curve for soil samples inoculated by 10X concentration gradient Thielaviopsis basicola

分别在五块烟草试验田中，进行五点取样，土样检测的结果如表2所示。结果表明，取自第1、2、3和4号田块的样品并没有检测到含有烟草根黑腐菌的孢子，而5号田块能够检测到烟草根黑腐菌的孢子，计算得到平均每克土壤有3483个孢子。

表3 各试验田土壤样品的检测结果Tab.3 Detection results of soil samples in different plots

2.5 试验田发病调查

在五月份烟草旺长期时，进行田间病害调查，以在烟草旺长期时，对田间进行病害调查，调查时将田间萎蔫、矮化和黄叶的烟株记为发病，各田块发病率如表4所示。从表中可以看出，5号田发病最为严重，达56.6%，远远高于其它田块中的发病率。

表4 各试验田块根黑腐病发病率Table 4 Incidence of black root rot of tobacco in different plots

3 讨论与结论

我国农业科技工作者在烟草根黑腐病的病原鉴定和病原菌检测方面开展了大量工作。边传红[2]、窦彦霞[7-8]等对烟草根黑腐菌进行了病原菌的分离和鉴定，确定了病原菌是T.basicola，并通过其种群内遗传研究发现，全国各地间的T.basicola的遗传多样性丰富，但是其在rDNA-ITS序列的差异基本没有变化。Paulin-Mahady 等[9]对Thielaviopsis的DNA研究发现T.basicola和该属的其它菌种的rDNA有明显的不同。陆星星等[4]和赵永强等[5]等通过设计特异的ITS引物，成功检测到T.basicola，康振辉等[6]通过该方法对土壤中T.basicola进行定量研究。本研究根据上述实验，设计特异性引物TbF/TbR 对T.basicola的DNA进行real-time PCR，反应的结果与引物Tb5/Tb6的结果相比较，可以看出TbF/TbR的扩增效率更高，特异性更强。之后用接种10倍浓度梯度的T.basicola孢子的土样提取DNA作模板，用引物TbF/TbR进行realtime PCR得到土壤孢子的标准曲线：y = -1.5206x + 24.919，R2=0.9909（P＜0.01），通过数据分析发现结果重复性可靠，可以通过该方法定量检测烟田土壤中根黑腐病菌T.basicola孢子。在对5块试验田土壤进行T.basicola检测时，只有5号田检测到T.basicola，而后期的病害调查证实田块1、2、3和4号发病率远低于5号田块，与上述田间的病菌量检测结果一致。证明本研究建立的检测方法不仅能快速的定性检测土壤T.basicola的存在，还能进一步准确的检测田间的土壤带菌量。