NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响

孟盈，闫筱筱，王召军，张洪映，杨欣玲，杨永锋，崔红*

1 河南农业大学，烟草学院，郑州市文化路95号 450002；

2 河南中烟工业有限责任公司，郑州市陇海东路72号 450000

烟草植株的气生部分密被腺毛，对植株抗性和烟叶质量具有重要影响[1]。栽培烟草的腺毛主要由三种类型混合组成。其中，长柄分泌型腺毛为主要类型，是二萜和糖脂合成的重要场所，二者不仅是重要香气前体物质[2]，对蚜虫抗性也有较大影响[3]。短柄分泌型腺毛是叶面抗性蛋白的合成场所，在抑制孢子萌发和抵抗真菌侵染中起重要作用[4]。构成了烟株与环境间的物理屏障，可以有效地防御各种非生物胁迫及生物胁迫[5]。因此，提高腺毛密度是烟草品质和抗性改良的重要途径之一，而这依赖于对烟草腺毛形态发生分子机制的全面解析。

虽然，拟南芥单细胞腺毛发生分子机制研究已取得了突破性进展，但多细胞腺毛与单细胞腺毛在发生调控机制上有并不相同[6-8]。细胞周期蛋白（Cyclins）在真核细胞分裂过程中起调控作用，对细胞增殖及植物发育有重要意义[9]。Cyclins共有A、B、C、D、H、L、T、U、SDS和J18-type 10个家族，功能各不相同[10]。其中，B-型细胞周期蛋白（B-type cyclins）控制核内复制（G2）期转向分裂（M）期的转换[11]，过量表达CycB2的水稻能促进细胞分裂，加快水稻根系的生长，与CDKB2相互作用后调节水稻根系的生长发育[12]；在种子发育过程中也可以发挥作用，玉米CycB2与CDKA相互作用后，共同参与调控胚乳发育过程中的细胞周期[13]；对腺毛发生也有影响，CycB1;2在GL2启动子控制下在拟南芥腺毛中表达，可使单细胞腺毛转变为丛生的多细胞型腺毛[14]。SlCycB2是从番茄wooly突变体中发现的B型细胞周期蛋白基因，当SlCycB2的表达受到抑制时，非分泌型腺毛（III和V型）明显增多，分泌型腺毛（I和IV型）消失；当SlCycB2过表达时，非分泌型腺毛及分泌型腺毛都明显减少[15-16]。这反映出多细胞腺毛发生调控机制的精细和复杂性，也说明B型细胞周期蛋白在多细胞腺毛发生调控网络中具有举足轻重的地位。

烟草腺毛密度受到多种栽培因素[17-23]与环境因子[24-27]的影响，但其遗传调控机制还不清晰。虽然有研究表明NtCycB2在烟草中的过表达及在番茄中异源表达都出现抑制腺毛发生的现象[16]，但该基因在烟草中的表达模式及对不同类型腺毛发生的调控模式并未报道。为此，本研究采用RT-PCR技术，进行烟草K326 NtCycB2克隆和生物信息学分析，分别构建过表达载体和基因编辑载体进行遗传转化分析，通过腺毛形态的比较研究解析了，深入解析NtCycB2表达对烟草腺毛形态发生的调控作用，旨在为烟草叶面化学分子定向改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料烟草K326无菌苗培养于光照培养箱，培养温度为25℃、湿度为60%，光照条件为16 h光/8 h暗。

1.2 基因克隆和序列分析

利用Primer Primer 5.0软件设计NtCycB2克隆引 物（F1：ATGAGCCGAAGAAATGGAAAT，R1：CTAACTGATATTCCTCCTAGTAG）和高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C 10min；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35次 循 环；72°C 10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用天根公司DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物连接到pMD19-T载体，转化Escherichia coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，酶切鉴定后送深圳华大公司进行测序验证。

根据茄科基因组网站（https://solgenomics.net/）、中国烟草基因组数据库（V3.0）和拟南芥TAIR网站（https://www.arabidopsis.org）获取相关CycB2基因的序列。利用Prosite数据库（https://www.expasy.org/tools/）分析蛋白质的理化性质，使用ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam/）预测氨基酸分子量。利用Clustal Omega program（https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/）和MEGA5.0软件进行进化和多序列比对分析。利用NCBI Conserved Domain Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析CycB2基因的保守结构域。

1.3 基因表达模式分析

选择五叶期生长一致的幼苗进行非生物胁迫处理：100µmol·L-1MeJA溶液进行外源激素处理，150mmol·L-1NaCl溶液进行高盐胁迫，20% PEG6000溶液进行渗透胁迫，4℃进行低温胁迫和42℃进行高温胁迫。分别在胁迫处理0、1、6、12和24h进行样品收集，经液氮速冻后保存于-80℃。Trozol法提取RNA。反转录程序参照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒说明书进行。

以烟草L25核糖体蛋白（L18908）（F2：GCTTTCTT CGTCCCATCA，R2：CCCCAAGTACCCTCG TAT）为内参[28]，按照Invitrogen公司的2×RealStar Green Fast Mixture（SYBR Green）试剂盒说明书，利用F1/R1引物进行实时定量RT-PCR。20 μL反应体系：SYBR Green Mix 10.0 μL，上、下游引物（10.0 μmol L-1）各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNasefree H2O 8.0 μL。反应条件为95°C 10 min；95°C 10s，60°C 30s，72°C 30s，40次 循 环；在72°C延伸步骤收集荧光信号，溶解曲线为：95°C，15s。采用2-△△Ct法[29]进行误差分析。

1.4 载体构建

利用NtCycB2克隆引物（F3：CGGGATCCATG AGCCGAAGAAATGGAAAT，R3：CGGAATTCC TAACTGATATTCCTCCTAGTAG，下划线标注的酶切位点分别是BamHI和EcoRI）进行PCR扩增。将测序正确的目的基因连接到过表达载体构成pCXSNFLAG-NtCycB2。

根据测序得到的NtCycB2的CDS序列，首先设计并合成gRNA靶位点序列（Targeting Sequence：GATCAACCACCCACAAGTGG，下划线标注的是Protospacer Adjacent Motifs，即PAM区），并添加BsaI酶切位点。Oligo二聚体与CRISPR/Cas9载体进行连接：CRISPR/Cas9载体2.0μL，Oligo二聚体1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，无菌水H2O补充至10.0 μL。最后将连接产物转化至农杆菌中构成NtCycB2-knock out基因编辑载体（图1）。

图1 NtCycB2基因敲除载体结构Fig.1 Vector structure of NtCycB2-knock out

1.5 烟草遗传转化与鉴定

烟草转基因采用叶盘转化法[30]。NtCycB2过表达载体和基因敲除载体转化后将叶片组织转移到含有潮霉素（60.0 mg·L-1）的分化培养基上进行分化培养和抗性筛选。获得的敲除表达抗性株系进行靶位点附近序列的测序分析，通过检测靶位点碱基突变情况确定敲除株系。

利用F1/R1引物对过表达抗性株系进行RT-PCR检测分析，方法同1.3。

1.6 腺毛形态观察

叶片腺毛组织化学染色法参考Lin和Wagner的方法[31]。将叶片在0.2%（w/v）罗丹明B水溶液中浸染30min，用蒸馏水漂洗三次，使用无菌滤纸吸干表面水分后，利用超景深显微镜（基恩士VHR-5000，日本）对叶片表面进行观察，并在上表皮中部随机选择3个视野进行腺毛密度统计分析。

1.7 数据处理和统计方法

所有数据使用EXCEL进行整理，应用SPSS17.0软件（IBM，美国）进行显著性分析，数据处理采用单因子方差（One-way ANOVA）分析。

2 结果与分析

2.1 NtCycB2基因克隆及生物信息学分析

以K326的DNA为模板，利用NtCycB2克隆引物进行PCR扩增后，结果如图2所示。经测序发现该基因编码区长333bp，共两个拷贝，NtCycB2-1、NtCycB2-2核苷酸同源性达94%，氨基酸相似性100%。编码110个氨基酸，分子量为12.2kD，理论等电点为8.60，酸性氨基酸残基（Asp+Glu）总数为11，碱性氨基酸残基（Arg+Lys）总数为14，其分子式为C509H847N153O169S11。

图2 烟草NtCycB2基因克隆Fig.2 PCR amplification of NtCycB2

图3 NtCycB2蛋白与近源物种同源蛋白的多序列比对Fig.3 Multiple sequence alignment of NtCycB2 protein and relative species homolog protein

NCBI网站在线分析CycB2基因具有三个典型的Motifs：I、II和III（图3），其中，Motifi和II构成WD40结构域，MotifiII构成RING-Like结构域。蛋白序列比对分析结果表明K326 NtCycB2蛋白序列与其亲本绒毛烟草（NtomCycB2：Ntom_KB972106.1）和林烟草（NsylCycB2：Nsyl_KD960057.1）的蛋白序列相同，与香料烟巴斯玛（BXCycB2：Ntab-BX_AWOK-SS231466）、白 肋 烟TN90（TN90CycB2：Ntab-TN90_AYMY-SS4464）和红花大金元（HDCycB2：Ntab0642370.1）的蛋白序列也相同；而与本氏烟（NbCycB2-1：Niben101Scf10299g00003.1和NbCycB2-2：Niben101Scf10396g00002.1）蛋 白序列的同源性均为96.36%，与番茄（SlCycB2：Solyc10g083140）、拟南芥（AtCycB2：AT5G06270和AtCycB3：AT3G11600）蛋白序列的同源性分别为71.05%、52.38%、和51.20%。系统进化树分析结果也表明，CycB2在栽培烟草不同类型、不同品种及其亲本之间高度保守，但与本氏烟NbCycB2存在较大差异，与番茄SlCycB2及拟南芥AtCycB2的亲缘关系较远（图4）。

图4 CycB2蛋白的系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CycB2 protein

2.2 NtCycB2基因表达模式分析

为研究NtCycB2的组织表达特性，分别对烟草根、茎、叶、去腺毛叶、花和腺毛中NtCycB2表达水平进行RT-PCR检测分析，结果如图5A所示。腺毛和花中NtCycB2的表达水平最高，分别是根的7.6倍和5.2倍。NtCycB2表达水平在根和茎中较低，在叶片中相对较高，但在去腺毛叶片中明显降低。由此推测，NtCycB2主要在烟草腺毛中富集表达，这与SlCycB2在番茄腺毛中特异表达相一致。

图5 NtCycB2基因表达模式分析Fig.5 Response of NtCycB2 to different stress treatments

为研究NtCycB2对逆境的应答模式，采用RTPCR技术，分析了水分、盐、温度、MeJA等胁迫条件下叶片NtCycB2表达水平的变化规律。在PEG和NaCl处理下，NtCycB2表达水平随处理时间延长而逐渐降低（图5-B，C），表明干旱和盐胁迫对NtCycB2表达具有一定的抑制作用。在高温处理下，NtCycB2表达水平随处理时间延长而逐渐升高，而在低温处理下显示出明显降低的趋势，说明温度对NtCycB2表达具有一定的诱导作用。在MeJA处理12h时NtCycB2表达量陡升，在24h时又明显降低，表明了MeJA对NtCycB2表达的调控具有一定的时间效应。

2.3 遗传转化与筛选鉴定

2.3.1 NtCycB2基因敲除

采用农杆菌介导法将NtCycB2-knockout表达载体转化K326，对获得的潮霉素抗性苗进行PCR扩增和测序，在所检测的40株抗性苗中，有19株在靶位点序列检测到了双峰现象，编辑效率接近50%。在T1代中筛选中，获得了4个在靶位点序列发生了插入或缺失突变的纯合突变体。如图6显示，NtCycB2-ko-2的序列中第76碱基位置后出现C插入；NtCycB2-ko-3的序列中第73碱基位置的CCA缺失，第76碱基位置后出现C插入；NtCycB2-ko-15的序列中第73碱基位置的CCAC缺失；NtCycB2-ko-16第76碱基位置后出T插入。这些插入和缺失最终都导致了NtCycB2翻译的终止。

图6 NtCycB2基因敲除株系中NtCycB2序列分析Fig.6 Sequence analysis of NtCycB2 among different NtCycB2-knockout lines

2.3.2 NtCycB2基因过表达

采用农杆菌介导法将pCXSN-FLAG-NtCycB2表达载体转化K326，并对抗性芽/幼苗进行潮霉素抗性筛选。采用RT-PCR技术对该植株（NtCycB2-OE-1）和4个基因敲除株系（NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16）的纯合突变体进行NtCycB2表达水平分析，结果如图7所示。NtCycB2-OE-1植株中NtCycB2的表达量明显较高，是对照K326的3.1倍。而四个敲除株系中NtCycB2表达量与对照相近，表明其在转录水平并无明显变化。

2.4 NtCycB2转基因植株腺毛形态观察和腺毛密度分析

对NtCycB2敲除和过表达株系幼苗进行了形态学观察，结果如图8所示，NtCycB2-ko-2植株形态与对照相似，但茎和叶上的腺毛更为浓密，整个植株呈现多毛状态（图8B）。NtCycB2-OE-1植株与对照形态有所不同，不仅叶片和茎表面光滑少毛，而且叶面光亮、叶片卷曲，形状不规则（图8C）。

经罗丹明染色后对不同株系的腺毛进行观察，图8-D、E和F显示了NtCycB2表达对茎部腺毛发生的影响。与对照相比，NtCycB2-ko-2茎上腺毛浓密，腺柄较长，腺头较为饱满；而NtCycB2-OE-1茎表十分光滑，长柄腺毛几乎消失，仅观察到少量的短柄分泌型腺毛。图8-G、H和I显示了NtCycB2表达对叶面腺毛发生的影响。与对照相比，NtCycB2-ko植株叶面的腺毛数量显著增加，大部分为长柄分泌型腺毛，腺头着色较深，表明其物质代谢和分泌功能旺盛；而NtCycB2-OE-1叶面分泌型腺毛和非分泌型腺毛数量明显减少，仅有少量的短柄分泌型腺毛存留。

图8 NtCycB2基因敲除和过表达株系的腺毛分析（150×）Fig.8 Trichome analysis of NtCycB2 knock-out lines and overexpression line（150×）

分别取NtCycB2敲除株系和过表达株系的幼叶进行上表皮腺毛密度统计分析，结果如图9所示。4个NtCycB2敲 除 株 系NtCycB2-ko-2、NtCycB2-ko-3、NtCycB2-ko-15和NtCycB2-ko-16植株的叶面腺毛总数显著高于对照。其中，长柄型或短柄型的分泌型腺毛的密度都显著增加，而非分泌型腺毛的密度则没有明显改变。NtCycB2-OE-1株系中分泌型腺毛和非分泌型腺毛数量均显著减少，且均呈现显著性差异。该结果表明，NtCycB2对烟草腺毛发生尤其是分泌型腺毛的发生，具有明显的负向调控作用。

图9 NtCycB2敲除和过表达株系的叶面腺毛密度统计Fig.9 Statistics of trichome density of leaf surface of NtCycB2 knock-out line and over-expression line

3 讨论和结论

植物腺毛作为表皮细胞的特化结构，在植物抵御环境胁迫[32]和次生代谢产物积累[33]等方面发挥重要作用。烟草腺毛由多种分泌型和非分泌型腺毛混合组成，既形成了烟株与外界的物理屏障和化学屏障，同时又是重要的香气前体物质合成场所。因此，提高烟草腺毛密度是烟草的重要目标。但栽培烟草遗传背景狭窄、腺毛密度变异较小[34]，常规的杂交育种难以有所突破。而利用关键基因的表达调控进行分子改良，是烟草腺毛密度改良的主要途径。

模式植物拟南芥为代表的单细胞腺毛发生已被逐步解析[35]，但多细胞腺毛发生的分子机制还不清楚。最近研究发现番茄多细胞腺毛发生受到B型周期蛋白的调控，为烟草腺毛分子改良提供了理想的靶点。因此，本文克隆并分析了K326的B型周期蛋白NtCycB2。虽然NtCycB2氨基酸序列在栽培烟草不同类型和不同品种中高度保守，但与番茄SlCycB2相似性仅71.05%，预示二者之间的功能同中存异。为阐明NtCycB2在烟草腺毛发生中的调控作用，分别对该基因进行了过表达和敲除表达研究。形态观察发现，NtCycB2过表达植株茎和叶光滑少毛，叶片上除了少量短柄分泌型腺毛外，长柄分泌型和非分泌型腺毛基本消失；而NtCycB2敲除植株中茎叶呈现多毛现象，分泌型腺毛密度显著增加，而非分泌型腺毛无明显变化。该结果证明，NtCycB2对烟草分泌型腺毛具有显著的负调控作用，这与番茄的研究结果有所不同。番茄共有7种类型的腺毛，包括4种分泌型（I、IV、VI与VII）和3种非分泌型（II、III和V）[36]。SlCycB2对III和V型非分泌型腺毛具有明显的负调控作用，SlCycB2过表达和抑制都会导致I型腺毛的完全消失，对于其它类型腺毛发生无明显影响[16]。B型细胞周期蛋白在烟草和番茄中都具有调控腺毛发生的功能，但调控模式存在明显差异，其中原因并不清楚。这充分说明了多细胞腺毛发生调控机制的复杂性，其不仅具有物种特异性，也具有腺毛类型的特异性。而NtCycB2对烟草分泌型腺毛显著的负调控作用，预示其在烟草叶面化学定向改良中具有较大的应用潜力。其一，该基因的靶标-长柄分泌型腺毛是叶面化学物质合成的重要场所；其二，该基因的负向调控模式有利于基因编辑技术的应用，而基因编辑技术改良品种无疑具有较大的公众接受性和应用空间。

当然，在此之前还应充分评估NtCycB2表达对烟草生长发育的影响。NtCycB2表达模式分析发现，该基因主要在腺毛和花中高表达，这与SlCycB2相一致，预示其主要影响植物的腺毛和花器的发育过程。SlCycB2过表达导致了胚胎发育受阻和不育[37]，NtCycB2过表达使烟苗形态出现了异常，说明其过表达对植物生长发育和生殖有一定负作用。但到目前为止，还没有关于CycB2敲除影响植株生长发育的报道。在本研究中，NtCycB2敲除后，烟苗腺毛浓密，发育正常，生长旺盛，预示其在生产中具有较好的应用潜力。当然，下一步但还需要进行田间比较试验，以阐明NtCycB2敲除对烟株农艺性状、叶面化学、烟叶质量及其可用性的重要影响，为烟草叶面化学的定向改良奠定基础。