烟草18S rDNA染色体原位杂交技术优化研究

王金英，曹帅，党江波，梁国鲁，杨超，张艳，陈益银

1 西南大学，园艺园林学院，重庆北碚区天生街2号 400716；

2 中国烟草总公司重庆市公司，烟草科学研究所，重庆市北碚区天生路2号 400716

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是一项利用带有荧光标记的核酸探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术[1]。其基本原理是：基于核酸分子碱基互补配对原则，利用荧光基团标记的核酸片段作为探针，与染色体上的特定靶核酸序列进行杂交，形成专一的杂交分子，再用荧光显微镜检测杂交信号位点，从而实现靶核酸序列在染色体上的定位[2]。荧光原位杂交在植物学中可用于染色体的识别[3-7]、基因定位[8-11]、物理图谱的构建[12-13]、亲缘关系鉴定及多倍体起源研究[14-15]等应用；由此可以看出荧光原位杂交技术被广泛应用于生命科学研究领域，具有不可替代的作用。

目前被广泛应用的荧光探针主要是基1987年德国Boehringer Manheims 公司推出的地高辛探针标记及检测试剂盒。这种探针成本较低，敏感性更高，易于检测[16]。探针是原位杂交技术的核心，根据研究目的设计探针这一步骤至关重要。通常，探针需具适宜的长度，过长会影响探针的渗入，也会增加杂交时间，使杂交效率降低；过短则会降低探针的特异性，特异信号的强度较弱，使杂交信号难以检测[17]。然而，使用短序列探针可使杂交时间缩短，提高实验效率。因此，开发特异性较强的寡聚核苷酸探针在荧光原位杂交中有一定程度的应用，主要用于分析染色体中的串联重复序列[18-19]。而在烟草中未见使用寡聚核苷酸为探针进行原位杂交的报道。本文通过开发烟草18S rDNA 寡核苷酸探针，并采用较为简易的方法进行FISH，提供了一种简便、快捷的烟草18S rDNA 荧光原位杂交方法。

1 材料和方法

1 .1 试验材料

本试验所用材料为野生烟草N.plumbaginifolia（2n = 2x = 20）、云烟87四倍体、烟草五倍体（云烟87八倍体 × N.plumbaginifolia）、烟草六倍体（云烟87八倍体 × L-8四倍体）、云烟87八倍体。其中N.plumbaginifolia、云烟87四倍体引自中国烟草遗传育种研究（北方）中心，烟草五倍体由云烟87八倍体与 N.plumbaginifolia 杂交获得，烟草六倍体由云烟87八倍体与L-8四倍体杂交获得，云烟87八倍体由本实验室创制，这些材料均取自重庆市果树学重点实验室[20-22]。

1.2 试验方法

1.2.1 18S rDNA 长序列探针制备

（1）烟草基因组DNA 提取

采用改良CTAB 法[23]提取云烟87四倍体基因组DNA，稀释至50 ng/μL 后备用。

（2）18S rDNA 保守序列引物设计

根据 GenBank 注册序列 N.tabacum 18S rRNA gene（AJ236016.1），使用 Prime Premier 5.0 软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成。

（3）保守序列克隆与标记

采用20 μL 的反应体系，包含ddH2O 12.3 μL；10×Buffer 2.0 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP 2.0 μL；模版DNA 1.0 μL；Taq 0.2 μL；P(F) 0.5 μL；P(R) 0.5 μL。程序如下：95℃ 预变性5 min，95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30次，最后延伸72℃10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。以此PCR 产物为模版，通过PCR 法进行探针标记。体系如下：20 μL 的反应体系，其中包含有 ddH2O 11.8 μL；10×Buffer 2.0 μL；Mg2+1.5 μL；dNTP（含DIG - dUTP）2.5 μL；模版1μL；Taq 0.2 μL；P(F) 0.5 μL；P(R) 0.5 μL。标记程序同扩增程序一样。经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后在DNA 溶液中加入1/10体积3 mol/L pH = 5.2的醋酸钠，充分混匀，加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇，充分混匀，-20℃静置30 min，10000 r/min 离心10 min，移去上清液，70%乙醇洗涤，10000 r/min 离心5 min，移去上清液，置于真空干燥器中干燥，加入适量ddH2O，使DNA 溶解。

1.2.2 染色体的制备

以幼嫩的子房为材料制片得到有丝分裂中期染色体[24]：

（1）于晴天上午7:00-9:00，取烟草花序中花冠长度未及花萼长度一半的幼嫩花蕾，置于0.2 mmol/L的8-羟基喹啉溶液中；

（2）于7℃条件下48 h后用卡诺氏固定液（甲醇：冰醋酸=V : V=3 : 1）固定过夜；

（3）将固定过夜的花蕾经去离子水漂洗，去除固定液后分解获取子房，将子房分解为1 mm3大小的组织块；

（4）将组织块悬浮于混合酶液（3%纤维素酶+0.3%果胶酶，双蒸水配制），37℃孵育1-1.5 h；

（5）将酶液吸出，缓缓加入蒸馏水，10 min后吸出蒸馏水，加入卡诺氏固定液进行再固定；

（6）再固定20 min后即可进行涂片并以酒精灯火焰进行快速干燥；

（7）5% Gimusa染色后镜检。

1.2.3 18S rDNA 长序列的原位杂交

在云烟87四倍体有丝分裂中期染色体上进行FISH试验验证18S rDNA探针的特异性。实验步骤如下[25-26]：

（1）预处理：选取分裂相多、分散好、形态舒展、背景清晰有丝分裂中期染色体制片置于 60℃ 烘箱中烘烤 1 h ；用玻璃刀在制片背面标记出杂交区域；将制片浸入固定液或无水乙醇中褪去 Giemsa 染料；干燥后滴加 100 μg/mL RNase A，加盖玻片，37℃ 湿盒中处理 1 h；2×SSC 漂洗 3 min，气干；50 ng/μL 蛋白酶 K 在 37℃ 湿盒中处理 5 ～ 15 min；2×SSC 漂洗 3 min；将制片依次浸入 70%、85%、100% 的乙醇中进行梯级脱水，每次 3 min，气干。

（2）固定：用 4% 多聚甲醛常温条件下处理 10 min，2×SSC（柠檬酸钠盐）漂洗 3 分钟，70%、85%、100% 乙醇梯级脱水，每次 3 min，气干。

（3）染色体制片变性：在杂交区域滴加 70% 去离子甲酰胺，加盖玻片后在 75℃ 条件下变性 3 min，依次浸入预冷（-20℃）的 70%、85%、100% 乙醇中进行梯级脱水，每次 5 min，气干。

（4）杂交液的配制：用10 μL 20×SSC、20 μL 50%硫酸葡聚糖(DS)、3 μL10% SDS、1 μL 200 ng/μL探针DNA混合后用dd H2O定容至100 mL，配好后混匀，10000 r/min 离心 30～60 s。

（5）探针变性

采用热变性法进行探针变性，将装有杂交混合液的 PCR 管浸入 90℃ 热水中变性 10 min，迅速置于冰水中冷却 10 min 以上。

（6）杂交：在杂交区域滴加适量已变性的杂交液，加盖玻片后置于 37℃ 湿盒中杂交 16 h。

（7）洗脱：杂交反应完成后，在暗室中，将染色体制片浸入 42℃ 0.1% SDS（2×SSC配制）漂洗 5 min；42℃ 2×SSC 漂洗 5 min；42℃ 20% 甲酰胺（0.1×SSC 配制）漂洗两次，每次 10 min；42℃ 2×SSC 漂洗 5 min；常温 2×SSC 漂洗 5 min；气干。

（8）抗体孵育：滴加 5% BSA 于制片，37℃ 处理 5 min；滴加 20 ng/μL Anti - DIG - Rhodamine（5% BSA + 0.2% Tween - 20，4×SSC 配制），37℃ 孵育 60 min。

（9）洗脱：37℃ 0.2% Tween - 20（4×SSC 配制）漂洗两次，每次 5 min；气干。

（10）镜检：用含有 DAPI（4', 6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光衰减剂封片，DAPI 浓度 4 ng/μL。Olympus BX53 荧光显微镜镜检，Spot Cool CCD 采集图像。

1.2.4 18S rDNA 寡聚核苷酸探针设计、标记与原位杂交

（1）探针设计与标记

选取18S rDNA 上游引物序列FITC（异硫氰酸荧光素）对其5' 端进行修饰。对 18S rDNA 上游引物（F：5'CTGAGAAACGGCTACCACA3'）进行 BLAST 比对，分析比对结果，确定为保守序列后合成使用。

在云烟87四倍体、烟草五倍体（云烟87八倍体 × N.plumbaginifolia）、烟草六倍体（云烟87八倍体 ×L-8四倍体）、云烟87八倍体以及N.plimbaginifolia有丝分裂中期染色体上进行定位。染色体制片方法与1.2.2同。

（2）杂交

在前述杂交程序上稍有改动：杂交时间改为2 h，其余不变。洗脱：杂交反应完成后，将染色体制片依次浸入42℃和常温的2×SSC 中进行洗脱，每次5 min，常温空气中干燥后观察。以长序列探针为对照。

1.2.5 寡聚核苷酸序列探针简化方法杂交

以N.plumbaginifolia中期染色体为材料应用简化方法杂交，参照陈志[19]的方法进行：以2×SSC 配制杂交液，使探针终浓度为 2 ng/µL 进行杂交，杂交时间为2 h，杂交后直接用2×SSC 常温下洗脱2次，常温空气中干燥后观察。

1.2.6 N.plumbaginifolia 5S rDNA 和18S rDNA双色荧光原位杂交

（1）5S rDNA探针制备

供试探针是从拟南芥5S rDNA 序列中选取的一段长为20 bp 的高度保守序列（专利号：CN103409523A），由上海生工生物工程公司合成，并利用TAMRA （四甲基罗丹明）对其5＇端进行修饰。

（2）杂交

5S rDNA 寡聚核苷酸探针和18S rDNA 寡核苷酸序列为探针，按前述简易步骤进行杂交和洗脱空气干燥后观察。

2 结果与分析

2.1 18S rDNA保守序列的引物设计与扩增

利用Primer Premier 5.0进行引物设计，取得分最高者：上游引物（F）：5' CTGAGAAACGGCTAC CACA 3'，下游引物（R）：5' CCCATCCCAAAGTCC AAC 3'，预测扩增产物长度为254 bp，以此产物为探针进行荧光原位杂交较为合适。

1%琼脂糖凝胶电泳检测云烟87四倍体基因组DNA。结果显示：提取的DNA主带明显（图1a），无拖尾现象，点样孔几乎没有样品残留，说明纯度较高、完整性较好。核酸蛋白检测仪检测结果显示：提取的云烟87四倍体基因组DNA 在260 nm 处有明显的吸收峰，OD260 / OD280 在1.8 ～ 2.0范围内，表明DNA 纯度较高，可用于后续PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测18S rDNA 片段扩增检测，结果显示：约 250 bp 位置处产生单一条带（图1b），与预期片段长度一致，表明18S rDNA 片段扩增成功，可用于后续实验。地高辛的标记作用使DNA 的分子量发生改变，因此标记DNA 与未标记DNA 在琼脂糖凝胶中的泳动速度不同，标记DNA 分子量大，泳动速度慢，表现为电泳条带滞后。基于此原理，对未标记PCR 产物和标记PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：标记PCR 产物在250 bp 位置处产生单一特异性条带，（图1c）该条带略微滞后于未标记PCR 产物的条带，表明探针标记成功。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测图a.云烟87四倍体基因组DNA 提取电泳检测图（箭头指示gDNA 条带) b.18S rDNA 片段扩增电泳检测图（箭头指示18S rDNA 条带）c.18S rDNA 片段标记电泳检测图（有尾箭头指示未标记的18S rDNA 条带，无尾箭头指示已标记的18S rDNA 条带）Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection a.Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from Yunyan 87 tetraploid (The arrow indicates gDNA band) b.Agarose gel electrophoresis of 18S rDNA fragments amplified by PCR (The arrow indicates 18S rDNA band) c.Agarose gel electrophoresis of labeled fragments of 18S rDNA (The arrow with tail indicates unlabeled 18S rDNA band, The arrow without tail indicates labeled 18S rDNA band)

2.2 18S rDNA长序列探针FISH 验证

为验证18S rDNA 探针的特异性，在云烟87四倍体有丝分裂中期染色体上进行FISH试验，杂交时间为18 h。结果显示：观察到的特异性信号清晰而明亮，与背景荧光形成强烈反差，可清晰识别出8个18S rDNA 信号位点，（图2）表明探针特异性强，其序列可用于后续寡核苷酸探针设计。

图2 云烟87四倍体18S rDNA 长序列荧光原位杂交结果（A，DAPI；B，罗丹明信号；箭头指示杂交信号位点）Fig.2 In situ hybridization results of Yunyan 87 tetraploid 18S rDNA long sequence fluorescence (A, DAPI; B, Rhodamine signal; Arrows indicate hybridization signals)

2.3 相同时间（2 h）不同引物（长序列和寡聚核苷酸序列）的FISH 验证

图3 云烟87四倍体18S rDNA 长序列和寡聚核苷酸序列相同时间（2h）的原位杂交图（A，DAPI；A1，罗丹明信号；B，DAPI；B1，FITC；箭头指示杂交信号位点）Fig.3 In situ hybridization results of Yunyan 87 tetraploid 18S rDNA long sequence and oligonucleotide sequence for 2h (A, DAPI; A1, Rhodamine signal; B, DAPI; B1, FITC; Arrows indicate hybridization signals)

在云烟87四倍体中，长序列探针经2 h杂交后未见信号出现（图2 A1），而寡聚核苷酸序列探针经2 h杂交处理，即可获得清晰杂交信号（图2 B1 ）。寡聚核苷酸探针的位点数量与前述长序列探针所获得的探针数量一致。这表明寡核苷酸探针对18S rDNA 是特异的，可用于烟草18S rDNA 的染色体定位研究，且寡聚核苷酸序列探针的杂交时间可缩短至2 h，较大程度缩短了杂交时间。

2.4 基于18S rDNA寡聚核苷酸探针不同倍性烟草染色体的FISH

图4 18S rDNA 寡核苷酸探针以及简易步骤的FISH 结果图18S rDNA 寡核苷酸探针在不同倍性烟草上的FISH 验证 （A，烟草五倍体DAPI；A1，烟草五倍体FITC；B，烟草六倍体DAPI；B1，烟草六倍体FITC；C，云烟87八倍体DAPI；C1，云烟87八倍体FITC；D，N.plumbaginifolia DAPI；D1，N.plumbaginifolia FITC）和N.plumbaginifolia 18S rDNA 寡核苷酸探针简易步骤 FISH（E，N.plumbaginifolia DAPI；E1，N.plumbaginifolia FITC；箭头指示杂交信号位点）Fig.3 The FISH result diagram of 18S rDNA oligo-nucleotide probes and the FISH verification of 18S rDNA oligo-nucleotide probes in heteroploid tobaccos (A, Pentaploid tobacco, DAPI; A1, Pentaploid tobacco, FITC; B, Hexaploid tobacco, DAPI; B1, Hexaploid tobacco, FITC; C, Yunyan87 octoploid, DAPI; C1, Yunyan87 octoploid, FITC; D, N.plumbaginifolia, DAPI; D1，N.plumbaginifolia, FITC) and photomicrographs of 18S rDNA-FISH in N.plumbaginifolia using simple procedure (E, N.plumbaginifolia, DAPI; E1, N.plumbaginifolia, FITC; Arrows indicate hybridization signals)

2.5 不同倍性烟草材料中的18S rDNA位点

利用寡聚核苷酸序列探针对烟草五倍体、六倍体、八倍体以及N.plumbaginifolia进行了FISH。结果显示在不同倍性材料中的应用均较为良好。

烟草五倍体（图4 A1）、六倍体（图4 B1）、八倍体（图4 C1）以及N.plumbaginifolia（图4 D1）的染色体上分别能看到9个、12个、16个和2个信号位点，信号较强。结合前述云烟87四倍体的FISH结果可看出，烟草四倍体、六倍体和八倍体中18S rDNA位点数量与倍性呈正比，这表明在烟草基因组加倍过程中，位点数量无变化。五倍体烟草位点数目为四倍体烟草位点数目和N.plumbaginifolia位点的和，这表明远缘杂交也未使位点数量发生变异。

2.6 寡聚核苷酸序列探针简易方法进行N.plumbaginifolia染色体FISH

经简易步骤，即直接用 2×SSC 稀释短序列探针至2 ng/µL 进行FISH，得到结果显示，杂交信号位点的数目与信号强度与常规步骤（图4 E1和图4 D1）所得结果相同，可以明显判定信号位置。可见，简易步骤可以用于18S rDNA 寡核苷酸探针杂交液的配制。

2.7 基于双色 FISH 的 N.plumbaginifolia 5S 和18S rDNA 位点分析

N.plumbaginifolia中期染色体上观察到2个5S rDNA 位点，染色体核型显示其位于第1对同源染色体长臂靠近端部的位置（图5）；观察到两个18S rDNA 杂交信号位点，染色体核型显示其位于第8对同源染色体短臂的端部位置（图5）；双色荧光原位杂交实现了5S rDNA 和18S rDNA 在 N.plumbaginifolia 体细胞中期染色体上的同时定位，并识别出两对染色体。

图5 5S rDNA 和18S rDNA 寡核苷酸探针在N.plumbaginifolia 染色体上的双色荧光原位杂交（A，DAPI；B，TAMRA；C，FITC；D，B 和 C 的合成图；有尾箭头指示5S rDNA 杂交信号位点，无尾箭头指示18S rDNA 杂交信号位点）Fig.4 Dual-color FISH of 5S and 18S rDNA-FISH in N.plumbaginifolia (A, DAPI; B, TAMRA; C, FITC; D, The composite image of B and C; Arrows with tails indicate 5S rDNA hybridization signals, Arrows without tails indicate 18S rDNA hybridization signals)

3 讨论

探针是荧光原位杂交技术的核心。近年来，合成的寡核苷酸探针因其独特的优点倍受关注。首先，寡核苷酸探针的长度很短，具有低序列复杂性和低分子量，容易渗透到细胞的目标区域，因此所需杂交时间较短。据测算，长度为20 bp，浓度为100 ng/mL 的寡核苷酸探针只需10 min 就能达到其最大杂交率。而长度为2 kb，浓度为100 ng/mL 的探针需要16 h 才能达到其最大杂交率。其次，寡核苷酸探针可识别靶序列中的单碱基变化，因为短探针的单碱基错配能大幅降低杂交分子的Tm 值。另外，寡核苷酸探针可大量合成，因而成本低廉[27]。

本研究在经典rDNA 荧光原位杂交程序的基础上，设计出特异性良好的烟草18S rDNA 寡核苷酸探针，并将其成功应用于不同本倍性的烟草和野生烟草 N.plumbaginifolia 18S rDNA 的染色体定位研究，解决了现有烟草18S rDNA 荧光原位杂交探针标记、检测程序复杂，杂交耗费时间长的问题。由此我们认为对于重复单位较短且拷贝数较高的靶序列来说，这种探针设计方法是可行的。但是，对于重复单位较长或拷贝数不是很高的靶序列来说，这种方法不能保证适用。原因可能是：靶序列重复单位较长时，与靶序列结合的探针之间的物理距离相对较远，荧光基团无法在空间上集中形成可检测的荧光信号；靶序列拷贝数较少时，探针与靶序列结合的数量相对较少，荧光基团的积累量不足，导致杂交信号非常弱，现有光学手段难以检测。靶序列重复单位长度、拷贝数与荧光信号强度之间的定量关系有待进一步探究。

真核生物rDNA 是编码各种rRNA 前体的基因，包括5S rDNA 和45S rDNA，是高度保守的串联重复序列，其在染色体上的位置随物种的不同而有一定差异[28]。因此，rDNA 可作为染色体精确识别的有效标记45S rDNA 的每个重复单位依次编码18S、5.8S 和28S rDNA。大量研究表明，45S rDNA 与核仁的形成直接相关，由它构成的核仁组织区在形态上一般表现为染色体的次缢痕，与随体相连[29]。因此，45S rDNA 信号位点的数目和位置可以在一定程度上反映随体的数目和位置。18S rDNA 属于45S rDNA 的一部分，其定位位点与45S rDNA 一致。

在不同的报道中，烟草的45S rDNA（18S rDNA）位点数量不同，如Lim等[30]报道烟草品种（系）095-55为4个，Kovarik等[31]报道烟草45S rDNA（35S rDNA）位点为8个，而合成烟草株系Th37-1、Th37-8和Th37-9的位点分别为9个、8个和10个，Kitamura等[32]报道烟草品种BY-4的45S rDNA（18S rDNA）位点有8个。而本研究发现，云烟87的45S rDNA（18S rDNA）位点也有8个。这说明，烟草的45S rDNA位点数量存在一定的变化，不同品种的位点数量可能会不同。45S rDNA 位点在部分物种中为脆性位点[33-34]，这可能是造成该位点在不同株系（品种）中呈现多样化的原因。烟草的45S rDNA位点可能也是脆性位点，但这有待后续研究进行验证。不同倍性烟草材料中45S rDNA位点数量与倍性密切相关，这说明烟草在倍性变化过程中，其45S rDNA位点数量为发生变异。

Villa[35]的研究表明，N.plumbaginifolia的第8对染色体带有一个随体，可能是重复序列的位点[36]。本研究在N.plumbaginifolia 体细胞中期染色体上观察到1对18S rDNA 位点，位于第8对染色体的端部，表明该位置可能存在次缢痕结构，这与Villa的研究结果相近。Cho等[37]曾报道了N.plumbaginifolia的45S rDNA位点和5S rDNA位点，虽数量与本研究相同，但其位置与本研究的结果不同，这可能是其使用的株系与本研究所使用的株系不同。

4 结论

通对野生烟草N.plumbaginifolia 18S rDNA 探针设计制作以及N.plumbaginifolia 5S rDNA 和18S rDNA 的染色体定位，得到如下结论：

（1）自行设计制作的烟草18S rDNA 荧光原位杂交探针（254 bp）特异性强，在此基础上进一步设计的寡核苷酸探针（19 bp）经过FISH 验证，结果表明可用于烟草18S rDNA 的染色体定位研究。简易步骤在野生烟草 N.plumbaginifolia 染色体上的FISH 验证表明可用于18S rDNA 寡核苷酸探针杂交液的配制。

（2）利用已有的5S rDNA 寡核苷酸探针和自行设计的18S rDNA 寡核苷酸探针进行双色荧光原位杂交试验，实现了5S rDNA 和18S rDNA 在N.plumbaginifolia 中期染色体上的同时定位，并识别出两对染色体。