烟草NtSAP5基因克隆及干旱胁迫下的功能鉴定

白戈，杨大海，姚恒，谢贺

云南省烟草农业科学研究院，育种与生物技术研究中心，云南昆明圆通街33号 650021

外界环境条件能够显著地影响植物的生长和发育，植物为了能够适应外界逆境条件，进化出了复杂的生理及分子响应机制[1-3]。已发现多种植物基因参与到植物抗逆过程，如bHLH蛋白、NAC蛋白、AP2/EREBP等转录因子尤为重要[2,4-5]。其中一类转录因子Stress Associated protein （SAP）基因家族在调控植物抗逆过程中非常重要。该基因家族的大多数基因具有两个锌指基序，在N端具有一个A20结构域，在C端具有一个AN1锌指结构域[6]。

水稻的OSISAP1及OSISAP8基因能够被诸如冷、脱水、盐、重金属、伤害及ABA等多种逆境条件诱导，在水稻中过表达OSISAP1能够诱导WRKY76、OsRCI2-5等抗逆基因表达并提高水稻抗旱能力[7]。在烟草中过表达OSISAP1及OSISAP8基因会提高烟草的耐冷性、耐旱性、耐盐性[6,8]。水稻已鉴定出一组A20/AN1类型的锌指蛋白，包括ZFP177、ZFP181、 ZFP176、ZFP173、ZFP181、ZFP176及ZFP157，这些基因能够被冷、干旱及双氧水胁迫诱导。在烟草中过表达ZFP177能够提高烟草对高温及低温的抗性，但该转基因烟草对干旱及盐胁迫更敏感[9]。在拟南芥中过表达拟南芥内源AtSAP5基因能够显著的提高拟南芥的抗旱性，该基因所对应的T-DNA插入突变体则对干旱胁迫表现敏感[10]。SAP类锌指蛋白在植物干旱等逆境中发挥功能，其部分成员的抗旱功能在拟南芥、水稻等多个物种中得到了验证，但在茄科物种中物种自身的SAP类基因在干旱条件下的作用研究较少。本文克隆了烟草中NtSAP5基因并对该基因的组织特异表达及干旱条件下的转录水平进行检测，对过表达后的抗旱表型进行分析，为研究烟草对干旱响应及抗旱分子机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料、种植条件及干旱胁迫处理

用于基因表达分析的烟草栽培品种K326，种子由云南省烟草农业科学研究院保存。K326种子在花盆中萌发，在16小时光照、28℃，8小时黑暗、23℃培养箱内生长。

本文采用了2种干旱处理条件：一是6～7叶烟草幼苗，移出花盆，清水漂去根部的培养基质，用滤纸吸干根部水分；然后将烟草植株整体在空气中干燥，在处理的0 h、0.5 h、1 h取叶片样品，方法详见文献[7]；二是6～7叶时烟草幼苗停止浇水7天，观察抗旱表型。取样样本液氮速冻，保存于-80℃中用于RNA提取。

1.2 烟草RNA提取与cDNA制备

采用Qiagen RNeasy mini plant kit（Cat 74104 ）提取烟草的RNA。在冰上准备10 μL的反转录反应体系，包括2 μg总RNA、1 μL的50 μM oligo（dT）和1 μL的10 mM dNTP和适量经DEPC处理过的水，将该体系在65℃温浴5 min后，迅速置于冰上1 min。

将上述体系中加入2 μL的10× RT Buffer、4 μL的25 mM MgCl2、2 μL的0.1 M DTT、1 μL的RNaseOUT（40 U/μL）和1 μL的SuperScript III RT（200 U/μL）后，在50℃下保持50 min，并在85℃下使酶失活、在冰上冷却终止反应，即获得cDNA。

1.3 基因克隆

根据中国烟草基因组数据库基因ID Ntab0877490设计引物，采用PCR方法克隆获得候选基因片段，PCR扩增的详细步骤及注意事项请参考《分子克隆实验指南（上册）》。克隆上游引物NtSAP5-F：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC ATGGCTCAGAGAACAGAGAAAG-3',下游克隆引NtSAP5-R：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAG CTGGGTCTCAAAGTTTAACGATCTTCG -3'。（标下划线部分为gateway接头序列，用来发生重组反应将序列导入到pDONR-Zeo载体中）根据gateway BP反应将扩增获得到的片段通过重组反应导入到pDONR-Zeo载体中。然后将含有NtSAP5序列的pDONR-Zeo通过LR反应导入到gateway过表达载体pB2GW7中。

1.4 植物转基因

将含有NtSAP5片段的pB2GW7载体通过冻融法转化到农杆菌LBA4404中。然后采用叶盘法转化烟草品种K326。通过Basta抗生素筛选获得具有NtSAP5基因的过表达材料。

1.5 实时定量PCR

反应体系为20 μL，包括 10 μL 的2× SYBR buffer，1 μL的cDNA，正向、反向引物各1 μL，7 μL的水。反应程序为：94℃，1 min；94℃，30 sec，58℃，30 sec，40个循环；72℃，5 min。

所有qRT-PCR进行三次重复，以烟草内源26s核糖体 RNA基因为内参。内参引物：26S-F 5' -GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'；26S-R，5'- TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'。基因特异引物：NtSAP5-qRT-F，5'-CCAAGGTCGCATATCCTCAT-3'；NtSAP5-qRT-R，5'-GCCGGTTAATCCTAGCTTCC-3'。2-ΔΔCT方法计算倍数变化，三次生物学重复计算±SD，Error bars为±SD（n = 3）。

2 结果与分析

2.1 NtSAP5序列信息

在中国烟草基因组数据库中查找到该基因ID为Ntab0877490.1，该基因与拟南芥中AtSAP5基因最为同源，因此将该基因命名为NtSAP5。设计特异引物通过克隆获得NtSAP5的CDS编码区，该片段大小为500 bp左右。通过测序发现烟草NtSAP5基因的CDS序列为474个碱基，编码281个氨基酸，NtSAP5蛋白分子量为17513.94，等电点为9.5070。将其编码CDS序列与基因区间序列比对，NtSAP5基因没有内含子。在NCBI网站上通过Blasp比对发现NtSAP5蛋白与绒毛烟草一个蛋白（NCBI登录号为 XP_009631181）最为相似，氨基酸同源性达到97%。其次NtSAP5与栽培烟草中的一个蛋白（中国烟草基因组数据库基因ID为Ntab0779290）最为相似，氨基酸同源性达到93%。除了这两个基因，NtSAP5与茄科番茄、马铃薯中的同源基因编码蛋白的同源性较高，与水稻OSISAP1蛋白同源性较低，仅为60%。

分析NtSAP5蛋白的结构域，发现NtSAP5蛋白的N端与C端，在21-45、97-134氨基酸范围内分别编码一个A20与AN1结构域（图1），该结构域为一个锌指蛋白结构域，具有结合DNA的功能。

图1 .NtSAP5蛋白结构域注释Fig.1 Functional domain annotation of NtSAP5

2.2 NtSAP5基因各烟草组织表达量及干旱诱导表达量

采用RT-PCR方法检测NtSAP5基因在烟草根、叶片、茎、花、幼荚中的表达量，结果显示，NtSAP5基因在烟草根中优势表达，在茎和叶中表达量较少，在花中表达量最低（图2A）。干旱胁迫下的RT-PCR结果表明，NtSAP5基因在干旱胁迫处理1小时，2小时的时候表达量上调，而在干旱胁迫处理2小时后表达量下调（图2B），图2B的干旱胁迫方法采用的是空气干燥脱水处理[7]，与采用停止浇水处理干旱条件下的基因表达结果趋势一致，结果未附。

提取栽培烟草K326的RNA通过反转录获得cDNA，采用特异引物克隆获得NtSAP5基因的CDS片段，获得500 bp左右的目的片段，片段大小符合预期。将该片段的测序结果在中国烟草基因组数据库中进行Blastn比对，结果表明扩增序列与目的序列完全相同。将扩增得到的目的片段通过BP反应克隆到gateway pDONR-Zeo载体中。然后将在pDONR-Zeo载体中的目的片段经过LR反应克隆到gateway过表达载体pG2BW7中。将构建好的载体通过农杆菌转化烟草，通过抗生素筛选获得阳性转基因植株。

采样并提取转基因阳性植株及非转基因植株的RNA，经过反转录获得cDNA，采用real-time PCR检测基因的转基因植株NtSAP15的表达量。收取表达量显著增高的两个转基因植株的T0代种子，其中OE_1植株的NtSAP15的表达量比非转基因植株表达量增加5倍，OE_2植株的NtSAP15的表达量比非转基因植株标量上调27倍（图3）。

图2 NtSAP5基因烟草中各组织表达量及干旱胁迫表达量Fig.2 Expression of NtSAP5 gene in tobacco tissues and under drought stress

图3 NtSAP5过表达植株基因表达量Fig.3 Transcript-level expression analysis of two NtSAP5 overexpression lines

将两个独立的转基因T0代种子播种，分单株收获T1代植株种子。将从不同T1转基因株系收获的种子播种在浓度为20mg/L的Basta平板上，挑选出萌发后存活超过98%的转基因株系为转基因纯合株系。选取并种植纯合转基因株系及非转基因烟草植株，待植株长到6-7叶期时，停止浇水干旱胁迫处理，干旱处理7天。图4 为干旱胁迫处理7天NtSAP5过表达烟株与未转基因烟株表型，包括干旱胁迫处理过表达转基因植株OE_1、干旱胁迫处理过表达转基因植株OE_2、干旱处理非转基因烟草植株，其中OE_1、OE_2及非转基因植株各选3株植株。结果表明经过七天的干旱处理，过表达NtSAP5基因的烟草植株与非转基因植株相比具有明显的耐旱性，非转基因植株表现出明显的干枯表型，而两个独立的NtSAP5转基因株系叶片较为挺拔，尤其是OE_2转基因株系表现更强的耐旱性，这与OE_2株系中更高的NtSAP5表达量相吻合。

图4 NtSAP5转基因植株的抗旱表型Fig.4 Drought resistance phenotype of NtSAP5 transgenic lines

3 讨论与结论

本研究通过同源克隆获得了烟草中SAP5同源基因，将该基因命名为NtSAP5。通过克隆获得栽培烟草NtSAP5序列，该基因CDS区域长度为474 bp，蛋白编码长度为278 aa。NtSAP5基因没有内含子，其编码蛋白在N端具有一个A20结构域，在C端具有一个N1结构域，这两个结构域都是较为保守的锌指结构域，根据两个锌指结构域的存在，可推断该基因具有结合DNA的功能。水稻OSISAP1没有已知的核定位信号，但定位在细胞核中[11]，拟南芥AtSAP5具有一个核定位信号且定位在细胞核内。水稻OSISAP1能够通过A20锌指结构域与其它SAP成员如RLCK253相结合[10]。NtSAP5与水稻的同源基因类似，没有已知的核定位信号结构域（NLS），NtSAP5可能通过与其它转录因子结合被招募进细胞核内，同时也不能排除存在未知的核定位信号进入细胞核的可能性。

转录因子是植物逆境应答信号通路早期信号转导的重要成员。转录因子OSISAP1在水稻干旱胁迫下表达量先上升后下降，表明其在干旱的早期应答中发挥作用[12]。在本研究中，NtSAP5的干旱应答变化也出现先上升，而后缓慢下降，提示在NtSAP5同样在烟草抗旱的早期反应中行使功能。NtSAP5在根与叶片中表达量较高，在花与幼荚中表达量低，表明该基因在烟草的营养生长器官及营养生长阶段行使功能，该基因在根中的高量表达，提示该基因可能在在根对干旱响应中发挥作用，具体情况需要进一步的实验验证。

NtSAP5在栽培烟草K326中的过表达转基因纯合株系在干旱胁迫处理下，与对照相比具有明显的耐旱性。这些结果验证了该基因在烟草抗旱的生理过程中发挥功能。NtSAP5基因在拟南芥中的AtSAP5同源基因及水稻中的OSISAP1同源基因均能提高植物对干旱的抗性，但在茄科作物中，对该类基因的研究较少， NtSAP5基因增强烟草抗旱能力的结果，对SAP5等锌指蛋白基因在茄科作物中功能的研究提供了初步的证据。

本研究从烟草中克隆到一个锌指蛋白基因，命名为NtSAP5基因，其具有保守的A20与N1锌指蛋白结构域。NtSAP5基因在茄科的番茄及马铃薯中具有相应同源基因且同源性较高，在双子叶拟南芥与单子叶水稻中也均有同源基因但同源性相对较低。该基因在干旱胁迫下的表达量变化及在栽培烟草K326中过表达所呈现出的抗旱表型，表明该基因参与烟草抗旱早期应答的调控过程且具有显著增强烟草耐受干旱胁迫的功能。