综合评分法优选黄芪中6种皂苷类成分的提取工艺

王亚丽，田 曼，李 江，王昌利，葛人杰，李 欢，王 媚，颜永刚，张 岗

(陕西中医药大学 药学院，陕西 西安 712046)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge. var. mongholicus ( Bge.) Hsiao 或荚膜黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge 的干燥根[1]。中药黄芪是我国最常用的大宗中药材之一，具有补气健脾、升阳举陷、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌的功效，是补气要药，在中药中被誉为“补气圣药”。现代医学研究发现，黄芪中主要含有皂苷类、黄酮类、黄芪多糖、氨基酸、生物碱及微量元素等多种有效成分，具有增强免疫系统、抗氧化、延缓衰老、抗病毒等作用[2]。其中黄芪总皂苷是黄芪中主要的一类活性物质，具有降血压、降血糖、改善胰岛素抵抗活性、镇静镇痛、抗血栓、抗风湿、抗肿瘤、保护心脏等生物活性[3-8]。本实验在对黄芪中6种皂苷成分提取方法、提取溶剂进行初筛的基础上，以黄芪甲苷，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，异黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量为评定指标，采用综合评分与正交实验设计相结合优选黄芪皂苷最佳提取工艺条件，为黄芪皂苷成分的客观评价提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪系列：Empower pro色谱工作站，在线脱气机，四元高压梯度泵，自动进样器，柱温箱，Waters 2420 ELSD Detector检测器；KQ-2500E数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DK-98-II电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅有限公司医疗设备厂)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；FW177中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；标准检验筛(45目，孔径0.40mm)，浙江恒幸仪器设备制造有限公司。

1.2 试药

对照品黄芪甲苷(批号10212-201603)、黄芪皂苷Ⅲ(批号10215-201611)、黄芪皂苷Ⅱ(批号10214-201701)、异黄芪皂苷Ⅱ(批号20417-201701)、黄芪皂苷Ⅰ(批号10213-201610)、异黄芪皂苷Ⅰ(批号20416-201605)均购自南昌贝塔生物科技有限公司，质量分数均≥98%。黄芪Astragali Radix药材采自步长集团宕昌县黄芪种植基地，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranace-us(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。实验用水为娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司生产；乙腈和甲醇均为色谱纯，购自美国赛默飞世尔科技有限公司；冰醋酸(色谱纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

建立同时测定黄芪中6种皂苷成分含量的HPLC方法。

2.1.1色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温 25 ℃；流动相为 0.3% 冰醋酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～12 min，18% B；12～35 min，18% B→30% B；35～43 min，30% B；43～60 min，30% B→55% B；60～70 min，55% B→70% B；70～80 min，70% B→100%B；系统平衡时间 20 min；流速 1.0 mL/min；进样量 10 μL；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度 60 ℃，喷雾器温度 36 ℃，增益值 130，供气压力 80 psi。对照品及样品的液相色谱见图1。

t/min

注：1.黄芪甲苷;2.黄芪皂苷Ⅲ; 3.黄芪皂苷Ⅱ;4.异黄芪皂苷Ⅱ; 5.黄芪皂苷Ⅰ; 6.异黄芪皂苷Ⅰ

图1 混合对照品溶液D(A)及样品(B)的HPLC-ELSD色谱

2.1.2 对照品溶液制备 精密称定对照品黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ适量，用甲醇超声溶解制成含有100 μg/mL黄芪甲苷、500 μg/mL黄芪皂苷Ⅲ、200 μg/mL黄芪苷Ⅱ、80 μg/mL异黄芪皂苷Ⅱ，1 300 μg/mL黄芪皂苷Ⅰ、520 μg/mL异黄芪皂苷Ⅰ的混合对照品溶液C；精密称定对照品黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ适量，用甲醇超声溶解制成含有60μg/mL黄芪甲苷、270μg/mL黄芪皂苷Ⅲ、100 μg/mL黄芪皂苷Ⅱ、50 μg/mL异黄芪皂苷Ⅱ、650 μg/mL黄芪皂苷Ⅰ、250 μg/mL异黄芪皂苷Ⅰ的混合对照品溶液D。分别将混合对照品溶液C、D放于4 ℃冰箱中保存，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 将黄芪药材于50 ℃干燥24 h，打粉，过45目筛，精密称量粉末5.0 g，置500 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇200 mL，浸泡12h后，加热回流提取3次，每次1 h，过滤，滤液蒸干，加入100 mL水溶解残渣，将溶液转移到分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次200 mL，弃去石油醚层，将非石油醚层转移到蒸发皿中，浓缩干燥，加甲醇定容到10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续虑液，即得。

2.1.4 线性关系考察 将“2.1.2”项下混合对照品溶液D按“2.1.1”色谱条件依次进样2 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、16 μL，重复测定3次，以进样量的对数为横坐标(X)，峰面积的对数(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围见表1。

表1 6种皂苷类成分的线性关系与线性范围

2.1.5 精密度试验 取混合对照品溶液D，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，每次进样量10 μL，计算黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ的峰面积RSD分别为1.62%、2.01%、1.59%、1.98%、2.29%、2.36%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性考察 依据最优提取工艺，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ的峰面积RSD分别为2.25%、2.21%、1.72%、2.10%、2.83%、2.41%，结果表明本实验的重复性良好。

2.1.7 稳定性考察 取最优提取工艺所得供试品溶液，分别在制备后的0、4、8、12、16、24 h各进样1次，每次进样量10 μL，测定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ的峰面积RSD分别为2.09%、2.15%、2.77%、2.26%、2.53%、2.64%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.1.8 加样回收率 精密称定同一批已知含量的黄芪粉末1.0 g，共6份，分别精密加入混合对照品溶液C1.0 mL。按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，进样量15 μL。结果黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ的平均回收率依次为102.75%、98.89%、96.91%、100.06%、99.34%、96.68%，RSD依次为2.48%、1.75%、2.16%、2.68%、2.76%、2.59%。

2.2 黄芪中6种皂苷成分提取工艺研究

2.2.1 提取方法考察 (1)超声提取法：精密称取黄芪粉末:5.0g，置500mL的锥形瓶中，精密加入甲醇200mL，浸泡12h后，超声提取1次，提取1h，即得超声提取液。

(2)回流提取法：精密称取黄芪粉末5.0 g，置500 mL的圆底烧瓶中，精密加入甲醇200 mL，浸泡12 h后，加热回流提取1次，提取1 h，即得回流提取液。

将上述两种提取方法所得提取液按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，从6种皂苷类成分的总提取量来看，甲醇回流法提取量较高。结果见表2。

表2 不同提取方法对6种皂苷类成分总提取量的影响 (mg·g-1)

2.2.2 提取溶剂考察 精密称取黄芪粉末5.0 g，置500 mL的圆底烧瓶中，精密加入提取溶剂200 mL，浸泡12 h后，加热回流提取时间1 h，提取1次，考察80%甲醇与不同体积分数乙醇(80%、90%、95%)提取对黄芪中6种皂苷类成分含量的影响。结果表明甲醇比乙醇更适合用来提取黄芪中这6种皂苷类成分。结果见表3。

表3 不同提取溶剂对6种皂苷类成分总提取量的影响 (mg·g-1)

2.2.3 醇提工艺的因素和水平优化 以上试验表明选用80%甲醇加热回流提取黄芪中6种皂苷类成分较合适，为优化甲醇回流提取工艺，对甲醇体积分数(因素A)、提取时间(因素B)及提取次数(因素C)进行了3因素3水平的正交试验。因素水平见表4。

表4 正交试验因素水平

精密称取黄芪粉末各5.0 g，按照L9(34)正交试验设计表中确定的条件进行实验，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，分别计算这6种皂苷类成分的含量，并进行多指标综合评分。评分时以各指标的最大值为参照对数据进行归一化，再给出各指标的权重。赋予指标权重采用专家评分法，即同行专家依据黄芪中这6种皂苷类成分在黄芪总皂苷提取工艺整体评价中的相对重要程度，独立给出各指标的权重系数；查阅近10年来黄芪药材中黄芪皂苷类成分提取工艺以及含量测定相关文献107篇，其中83篇检测了黄芪甲苷，18篇检测了黄芪皂苷Ⅲ，22篇检测了黄芪皂苷Ⅱ，20篇检测了黄芪皂苷Ⅰ，4篇检测了异黄芪皂苷Ⅱ，2篇检测了异黄芪皂苷Ⅰ。将专家评分法与各指标在近10年来黄芪皂苷类成分提取工艺以及含量测定相关文献中被检测的频率统计相结合对各指标设定权重，同时，鉴于黄芪甲苷是黄芪中增强机体免疫的主要有效成分之一[9]，并通常作为评价黄芪药材及制剂质量的常用指标性成分，故本实验取权重系数分别为：黄芪甲苷权重为0.6，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ权重均为0.1，异黄芪皂苷Ⅰ权重为0.04、异黄芪皂苷Ⅱ权重为0.06。按照下列公式求出综合评分值(Y)，以综合评分值进行统计分析。正交试验安排及结果见表5，方差分析见表6。

Yi=0.6X/0.1212+0.1×(Z/0.6447+M/0.2751+N/1.6691)+0.06P/0.1134+0.04Q/0.6020，(X为黄芪甲苷含量、Z为黄芪皂苷Ⅲ含量、M为黄芪皂苷Ⅱ含量、N为黄芪皂苷Ⅰ含量、P为异黄芪皂苷Ⅱ含量、Q为异黄芪皂苷Ⅰ含量)，i=1,2,3,.....9。

表5 正交试验结果 (mg·g-1)

表6 正交试验方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00。

2.2.4 正交试验结果分析 以综合评分值为标准，由表5直观分析可知，在所选因素水平范围内，各因素的作用主次顺序为A(提取溶剂体积分数)>C(提取次数)>B(提取时间)，理论上以A1B2C3为最优组合，即80%甲醇回流提取3次，每次提取2 h。由表6方差分析结果表明，因素A(甲醇体积分数)和因素C(提取次数)均为主要影响因素，对各指标成分的提取有显著性影响(P<0.05)，因素B(提取时间)对提取结果不具有显著性影响(P>0.05)，由于提取时间对试验结果的影响经统计学检验不具有显著性，为了降低成本、节约时间、提高效率，故最终确定最优组合为A1B1C3，即80%甲醇回流提取3次，每次提取1 h。

2.2.5 正交验证试验 为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性，取3份药材按筛选得到的最佳提取工艺A1B1C3进行正交验证试验，结果黄芪甲苷，黄芪皂苷Ⅲ、Ⅱ，异黄芪皂苷Ⅱ，黄芪皂苷Ⅰ，异黄芪皂苷Ⅰ的平均提取量分别为0.1098、0.4783、0.2694、0.1256、1.4356、0.5496mg·g-1，RSD值均小于2.74%，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 流动相的选择

在实验前，通过查阅大量文献发现，HPLC-ELSD法测定黄芪皂苷类成分含量时选用的流动相主要有乙腈-酸水溶液[10-12]和乙腈-水[13-17]洗脱系统，经实验考察，乙腈-0.3%冰醋酸作为流动相时，基线噪音小，色谱峰的分离度、峰形均优于乙腈-0.3%甲酸溶液和乙腈-水，由于考虑到酸性洗脱系统对色谱柱的损害，为保护色谱柱，所以适当降低冰醋酸浓度，但随着冰醋酸浓度的降低，色谱峰灵敏度亦随着变低，故本实验最终采用乙腈-0.3%冰醋酸溶液作为流动相。

3.2 评价指标的选择

通过查阅文献，黄芪中黄芪甲苷，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，异黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ等皂苷类成分具有抗肿瘤、抗肝纤维化、抗衰老、抗炎和免疫调节等药理作用。采用单一指标成分进行工艺优选与中药多组分、多靶点的作用特点有一定偏离，考虑到单一成分作为中药提取工艺评价指标的局限性，故本实验以黄芪中6种皂苷类成分的含量作为研究指标。

3.3 数据处理分析

据文献报道，黄芪皂苷提取主要以总皂苷或黄芪甲苷工艺筛选为主，涉及的成分过于笼统或单一，考虑其药理作用较少。故本实验采用多指标综合评分法结合正交试验设计来筛选黄芪中6种皂苷类成分最佳提取工艺。不仅利用正交试验方法进行相关因素和水平的考察，同时也考虑到了黄芪甲苷和其他5种具体的皂苷成分的含量和药理作用。采用多指标的正交试验设计进行工艺优选时，首先需要针对指标间的重要性差异给各指标设定权重系数，进行综合评分后再做统计分析。本实验从专家评分和近10年来相关文献统计情况两方面考虑，最后给出各指标权重，这样进行统计分析优选出的工艺更具有科学性和合理性，为后期黄芪的进一步开发利用提供了实验参考。