水果酵素体外抗氧化及抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的研究

李云姣 李 琪 杜佳峰 陈杨扬 刘坤娜 桑亚新

（河北农业大学食品科技学院 河北保定071000）

酵素按发酵原料种类可分为植物酵素、 菌类酵素和动物酵素。水果酵素即以一种或多种水果为原料，经微生物发酵而产生的酵素食品[1]。水果是水溶性维生素、植物甾醇、膳食纤维、维生素和生物活性物质的良好来源。水果经发酵后，不仅可以最大限度保留水果的营养成分，而且在发酵过程中产生其它的生物活性，可以增强营养，延长水果的保质期[2]。

酵素食品在韩国、日本及东南亚地区甚为流行，近些年在国内市场也开始流行，而国内关于水果酵素的研究尚处于起步阶段。虽然酵素宣称具有各种功效，但研究主要集中在抗氧化，消炎抗菌和解酒护肝等方面，如葡萄酵素、火龙果酵素、桂圆酵素、核桃青皮果蔬酵素等[3-7]，对其功能性的研究还不够全面和明确，关于降血糖活性方面的研究更少，对水果酵素降血糖的作用及其机理的研究也鲜有报道。而高血糖是目前已知的并发症最多的一种疾病，可引发高血压、心血管疾病、糖尿病神经病变等100 多种疾病[8]。控制糖尿病的方法之一是控制餐后高血糖，这可以通过抑制存在于胃肠道的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性来实现[9]。且在其它发酵果蔬汁中已发现有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的潜力，如发酵蔬菜汁、发酵梨汁[10-11]等。

本试验中以多种新鲜水果为原料进行自然发酵，测定水果酵素的抗氧化活性，并对其体外降血糖活性做初步探究，旨在探索水果酵素更多的功效，为进一步明确水果酵素的功能提供了参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

苹果、香蕉、梨、山楂、火龙果、香橙、柠檬、柚子、葡萄、猕猴桃、红糖（一级品）市购。

α-淀粉酶（猪胰腺）、α-葡萄糖苷酶（来自黑曲霉）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、没食子酸（分析标准品），上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖，拜耳医药保健有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯级。

K5600 型超微量分光光度计，北京凯奥科技发展有限公司（KAIAO）；酶标仪，美国Thermo 公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理[3]选取苹果、香蕉、梨、山楂、火龙果、香橙、柠檬、柚子、葡萄、猕猴桃10 种新鲜水果，用无菌水洗净，切成大小均匀的小块，混合。将水果与红糖以质量比1∶1 加入到已灭菌的发酵罐中，封口，常温条件下自然发酵。分别在发酵0，30，60，90，120 d 时取出一定量的样品，10 000 r/min 离心10 min 弃去沉淀，取上清液保存在-20℃，用于分析。不同发酵时期的水果酵素即为水果酵素原液，由于原液浓度较高，试验时将其稀释至不同浓度。

1.2.2 理化指标的测定

1） pH 和总酸的测定：参照GB/T12456-2008《食品中总酸的测定》[12]。

2） 还原糖的测定：DNS 比色法[13]。

3） 蛋白质的测定：考马斯亮蓝法[14]。

4） 可溶性固形物含量的测定：手持折光仪。

1.2.3 总酚含量的测定[15]参照GB/T 31740.2-2015 茶多酚含量的测定。

1.2.4 DPPH 自由基清除能力的测定[16]以无水乙醇溶解DPPH·制得20 mmol/L 的DPPH·溶液。分别将酵素稀释至原液浓度的0.67%，0.8%，1.00%，1.33%和2.00%，取2 mL 稀释后的样品加入到2 mL DPPH-乙醇溶液中混匀，室温下反应30 min，测定波长517 nm 处的吸光度，0.01 mg/mL的抗坏血酸作为阳性对照。

式中，A0——空白对照液的吸光度；A1——样品测定管的吸光度；A2——样品对照管的吸光度。

1.2.5 ABTS 自由基清除能力的测定[17]将7 mmol/L ABTS 和4.9 mmol/L K2S2O8等体积混合，在室温下黑暗反应12～16 h。使用前将ABTS 自由基反应液用5 mmol/L 的PBS 稀释40～50 倍，使其在734 nm 处的吸光度为0.7±0.02。取200 μL 稀释至原液浓度的0.67%，0.8%，1.00%，1.33%和2.00%的样品，与800 μL 上述稀释液混合，30℃下反应6 min，在734 nm 波长下测吸光度。计算公式同（1）。

1.2.6 α-淀粉酶活性抑制试验 α-淀粉酶的活性测定根据McCue 等[18]的方法略作改动。取500 μL 体积分数为2%，4%，6%，8%和10%的样品，与500 μL 0.5 mg/mL α-淀粉酶溶液 （6.5 U/mL）在37 ℃下预混合10 min 后，加入500 μL 1%可溶性淀粉溶液起始反应，反应所用缓冲液为0.02 mol/L、pH 6.9（含0.006 mol/L NaCl）的磷酸盐缓冲液。反应混合液于37 ℃反应10 min 后，加入1 mL DNS 试剂终止反应，反应液置沸水浴中5 min 后于冰水浴中迅速冷却，加蒸馏水补足体积至15 mL 后测定540 nm 波长处吸收值，同时做样品对照。0.5 mg/mL 的阿卡波糖液作为阳性对照。

式中，As——样品组吸光值；Asc——样品对照组吸光值；Ac——阴性对照组吸光值；Abc——阴性空白对照组吸光值。

1.2.7 α-葡萄糖苷酶活性抑制试验 α-葡萄糖苷酶的活性测定根据McCue 等[18]的方法略作改动。以PNPG 为底物测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。取50 μL 体积分数为10%，20%，30%和40%的样品，与100 μL α-葡萄糖苷酶 （20 U/mL） 在40 ℃预混合10 min 后，加入20 mmol/L PNPG 50 μL 起始反应，反应所用缓冲液为0.1 mol/L、pH 5.5 的磷酸盐缓冲溶液。反应混合液于40 ℃反应60 min 后，加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，用酶标仪测定400 nm 波长处的吸收值，同时做样品对照。0.5 mg/mL 的阿卡波糖液作为阳性对照。对α-葡萄糖苷酶的抑制率按照公式（2）计算。

2 结果与分析

2.1 理化指标的测定结果

发酵120 d 的酵素理化指标结果如表1所示。

由表1可知，水果酵素的pH 值为3.51，有较高的酸度。蛋白质为0.34 mg/mL，含量均低于核桃青皮果蔬酵素，总糖含量和可溶性固形物分别为259.32 mg/mL 和40.2%，均高于核桃青皮果蔬酵素[7]。

表1 酵素的理化指标Table1 Chemical composition in fermented fruit juice

2.2 总酚含量的测定

大量研究表明，多酚类化合物具有良好的体外抗氧化活性和抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性[19-21]。水果酵素中总酚含量如图1所示。

图1 发酵过程中总酚含量的变化Fig.1 Changes in total phenolic compounds during fermentation

由图1可知，在发酵过程中，酵素中总酚含量呈逐渐下降的趋势，与发酵前相比，发酵120 d后，多酚含量由2.97 mg/mL 降至2.23 mg/mL，差异显著（P＜0.05）。一方面，可能是由于酵素在发酵过程中激活了多酚氧化酶，促进多酚发生氧化聚合反应生成大的酚类聚合物[22-23]；另一方面，小的酚类物质在细菌和酵母的作用下发生了降解[24]。

2.3 DPPH 自由基清除能力的测定

DPPH 自由基是脂溶性自由基，是体外检测物质抗氧化效果最常用的一种方法。酵素在发酵过程中的DPPH 自由基清除率如图2所示。

从图2可以看出，酵素与发酵前相比，发酵30 d 后DPPH 自由基清除率下降，且差异极显著（P＜0.01）。发酵90 d 的酵素DPPH 自由基清除率较发酵60 d 时显著下降（P＜0.01），在发酵120 d时无明显下降。DPPH 自由基清除率发酵120 d 与发酵前相比，显著下降，当样品浓度为2.00%时，DPPH 自由基清除率由95.96%下降至87.19%，低于阳性对照93.82%。改变反应体系中样品浓度，结果发现随着样品浓度的增加，样品的DPPH 自由基清除率也随之增加，呈明显的剂量依赖性。DPPH 自由基清除率的变化与总酚含量变化相一致，酵素中总酚与DPPH 自由基清除率有较大的相关性（r=0.856），因此，酵素中DPPH 自由基清除能力的变化可能与总酚含量变化有关。

2.4 ABTS 自由基清除能力的测定

ABTS 法也是测定抗氧化活性较为常用的一种方法，其优点是可溶于极性溶剂和非极性溶剂[18]。图3为酵素在发酵过程中ABTS 自由基清除能力的变化。

由图3可知，酵素在发酵30 d 时ABTS 自由基清除能力下降，在样品浓度为0.67%～1.00%时差异显著（P＜0.01）；在发酵60 d 时ABTS 自由基清除能力显著增加（P＜0.01），只有样品浓度为2.00%时增加不显著；在发酵90 d 和120 d 时，ABTS 自由基清除能力基本保持不变，当样品浓度为1.00%～2.00%时，清除率可达到95.49%～100.00%。与阳性对照0.125 mg/mL VC 相比，酵素的ABTS 自由基清除率显著高于相同体积的VC溶液（P＜0.01）。改变反应体系中样品浓度，结果发现酵素对ABTS 自由基的清除率随着样品浓度的增加而增大，表明酵素对ABTS 自由基的清除能力呈一定的剂量效应。经试验测得，酵素中总酚含量与ABTS 自由基清除能力的相关度较低，因此推断酵素中存在多酚类以外的物质在起作用或是多酚同多种生物活性物质共同作用的结果。

2.5 α-淀粉酶活性抑制试验

水果酵素在自然发酵过程中对α-淀粉酶的抑制作用如图4所示。在发酵过程中，酵素对α-淀粉酶的抑制作用增加，在发酵30 d 时，对α-淀粉酶的抑制率增加极显著（P＜0.01）。样品浓度为4%时，抑制率从23.80%增加至99.57%，即发酵120 d 的水果酵素对α-淀粉酶的抑制作用增加了318.34%。而0.5 mg/mL 的阿卡波糖液对α-淀粉酶的抑制率为35.76%，因此，水果酵素的α-淀粉酶抑制活性高于0.5 mg/mL 的阿卡波糖液，大约相当于同体积的浓度为1.39 mg/mL 的阿卡波糖液。样品的α-淀粉酶抑制率在发酵0 d 时，随着反应体系中样品浓度的增加而增加，在发酵30 d 及以后，剂量效应并不明显。研究表明，除了植物多酚，如苹果多酚等具有α-淀粉酶抑制活性以外[21]，大量的天然多糖也具有较好的抗糖尿病功能，如苦瓜多糖就显示出显著的α-淀粉酶抑制活性[25-26]。水果酵素的α-淀粉酶抑制率与多酚含量呈高度的负相关性（r=-0.968），这说明虽然多酚可以调节对α-淀粉酶的抑制效果，但在水果酵素中还存在除多酚类以外的生物活性物质，也具有抑制α-淀粉酶活性的作用。

2.6 α-葡萄糖苷酶活性抑制试验

样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果如图5所示。酵素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用在发酵过程中呈缓慢增长的趋势，在发酵90 d 时下降，随后又有所增加。从发酵初始至发酵结束，样品的α-葡萄糖苷酶抑制率由73.98%增加至81.67%，增加了10.39%。阳性对照0.5 mg/mL 的阿卡波糖液对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到84.54%，略高于酵素，酵素对α-葡萄糖苷酶的抑制效果大约相当于0.48 mg/mL 的阿卡波糖液。不同浓度样品的α-葡萄糖苷酶抑制率呈现出一定的剂量效应，随着样品浓度的增加而增大。水果酵素的α-葡萄糖苷酶的抑制率与多酚呈较低的负相关，这可能是因为多酚、有机酸、多糖、蛋白质等对α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，且抑制作用可能有协同作用[20]。

图2 发酵过程中DPPH 自由基清除率的变化Fig.2 Changes of DPPH free radical scavenging activity during fermentation

图3 发酵过程中ABTS 自由基清除率的变化Fig.3 Changes of ABTS free radical scavenging activity during fermentation

图4 水果酵素对α-淀粉酶的抑制作用的变化Fig.4 Changes in inhibitory effect of sample against α-amylase

图5 水果酵素对α-葡萄糖苷酶抑制作用的变化Fig.5 Changes in inhibitory effect of sample against α-glucosidase

3 结论

本文研究了水果酵素在发酵过程中抗氧化活性和对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果表明，水果酵素具有良好的抗氧化活性和较好的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。其中，DPPH 自由基清除率随着发酵时间延长，在发酵120 d 时可达到87.19%；ABTS 自由基清除率增加，在发酵120 d 时达到100.00%。对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性在发酵过程中增加，分别达到100%和81.67%。水果酵素表现出较高的抗氧化活性和α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有很大的降血糖潜力，为进一步研究水果酵素的其它功能奠定基础。