酶法富集DHA、EPA的研究进展及产业化展望

2019-05-18郑振霄戴志远宋恭帅过雯婷

中国食品学报 2019年4期

郑振霄戴志远，2* 沈清，2 宋恭帅过雯婷薛静，2

（1 浙江工商大学海洋食品研究院杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室杭州310012）

DHA（二十二碳六烯酸）和EPA（二十碳五烯酸）是n-3 系列多不饱和脂肪酸（PUFA）的重要组成成员，在它们的结构中分别有6 个和5 个不饱和双键，对人体的健康起到重要调节作用。从DHA、EPA 的发现到应用，经历了上百年的探索。19 世纪末期，Heyerdahl[1]提出鳕鱼肝油的保健作用是由n-3PUFA（多不饱和脂肪酸）引起的，并且他建议给它们命名为“治疗的酸”，这是人类早期研究DHA、EPA 的典型代表。第二次世界大战后，Notevarp[2]指出DHA、EPA 与心血管疾病的发病率有着密切的联系。20 世纪70年代，丹麦科学家Bang 和Dyerberg[3]发现常食用鱼类、海兽或鱼油的爱斯基摩人的心肌梗塞、中风等心脑血管疾病的发病率明显较低，通过调查分析得出爱斯基摩人心脑血管疾病发病率低的主要原因是摄入的海洋动物的长链不饱和脂肪酸较多。这份详细的研究报告掀起了现代人对DHA、EPA 的研究热潮。20世纪90年代，日本学者制备了高纯度的n-3PUFA，并开始将其应用于动脉硬化症与高血脂的治疗中[4]。21 世纪以来，随着分子生物学及临床医学的快速发展，DHA、EPA 在体内的作用机制逐步被揭示，以DHA、EPA 为主要成分的保健食品正走进更多的家庭，在人类生活中扮演着越来越重要的角色。DHA、EPA 是人体必需的n-3PUFA，对人体的正常生理功能起重要作用。研究表明，DHA和EPA 的生理功效主要有：①抗血小板凝聚，减少血栓形成，防治心肌梗塞；②降血脂，预防和治疗动脉粥样硬化；③抗炎症；④抑制肿瘤生长；⑤促进婴幼儿大脑的生长发育，预防老年痴呆，保护视力[5-12]等。虽然DHA 和EPA 的结构类似，但这两种物质的功能并不完全相同。DHA 主要对神经系统的调节作用比较大，EPA 则对心血管疾病的预防具有重要作用[13]。对DHA 和EPA 进行分离、纯化，制备出高纯度的DHA 和EPA 制剂，有很重要的现实意义。近年来，随着人们对鱼油中DHA、EPA 保健功能认识的不断深入，鱼油的市场销售价格也迅速增加，图1为1986-2014年鱼油价格变动趋势图。开发利用鱼油资源，制备富含DHA、EPA 的鱼油保健品，具有重要的商业价值。

图1 1986-2014年鱼油价格变动趋势图Fig.1 The price tendency of fish oil in the year of 1986 to 2014

DHA、EPA 分离纯化的传统理化方法有低温结晶法、分子蒸馏法、尿素包合法、超临界流体萃取法。低温结晶法虽工艺简单，操作方便，但需要回收大量的有机溶剂，且分离效率不高。曾晓雄等[14]做了大量的低温结晶法试验，所得EPA 和DHA 含量为40%左右。分子蒸馏法是利用混合物组分的挥发度不同而进行分离[15]。饶华俊[16]采用五级分子蒸馏分离鱼油原料，得到DHA+EPA＞60%的DHA 和EPA 粗品，然而，分子蒸馏需要高真空的设备，能耗较高，因此可以采取其它方法预处理后再用分子蒸馏方法。尿素包合法所需设备简单、操作成本低，然而该法需回收大量溶剂，产品纯度受到一定限制。朱世云等[17]讨论了不同脲包客体及溶剂种类对尿素包合物形成的影响。李国文[18]在1997年详细论述了尿包试验的路径及条件。硝酸银络合法虽可以制备出高纯度的DHA、EPA 单品，但硝酸银价格昂贵，回收率低，所以暂时只停留在实验室阶段。赵亚平[19]将含有EPA 和DHA 的乙酯化鱼油与硝酸银水溶液混合，结果有90%以上EPA 和DHA 与油相分离。陶遵威[20]采用硝酸银法也制备出纯度超过95%的DHA+EPA 的产品。超临界CO2萃取法通常对仪器设备的要求较高，并且超临界流体的生产代价较高，不利于大规模生产。总之，传统的物理化学法富集EPA 和DHA，其条件通常为高温、高压或者特殊的pH，这些会造成EPA、DHA 全顺式构型异构化、双键移位或聚合，并且操作成本高、消耗能量大，这些均不利于其应用于工业化生产并且在生产过程易发生副反应，产生对人体有害的物质[21-23]。

脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，作为生物催化剂不但可以催化油酯的水解反应，还能在酯合成和酯交换反应中发挥重要作用。研究表明[24]，细菌的28 个属、放线菌的4 个属、酵母菌的10 个属、其它真菌的23 个属的微生物都可以产生脂肪酶，不同来源的脂肪酶适合催化的反应类型不同，相应地对DHA 和EPA 的富集效果也不同[25]。一般在研究初期，需要根据选定的反应类型，结合现有的资料对脂肪酶进行筛选。目前已报道具有良好选择性的脂肪酶有来源于褶皱假丝酵母（Candida rugosa）、念珠地丝菌（Geotrichum candidum）等的脂肪酶，这些脂肪酶可以较好地保留2 位上的n-3PUFA，水解饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，故可以用来作为水解法富集DHA 和EPA 的催化剂[26]。酶法富集DHA、EPA 被认为是一种很有潜力的方法，因为酶富集方法的反应条件温和，具有高效性以及高度的专一性，可以有效降低氧化以及异构化的发生[27-28]。酶法生产的产品具有良好的感官特性，是生产制造保健食品和药品的优良来源。此外，酶法生产过程中的废弃物容易被微生物降解，生产产生的废水生物需氧量极低，有利于环境保护[29-30]。酶工程技术的快速发展为酶法生产DHA、EPA 提供了新的研究方法和研究思路，发酵罐培养技术、固定化酶技术的发展降低了酶法生产DHA、EPA 过程中的生产成本，为酶法富集DHA、EPA 的工业化生产提供新的思路[31]。

本文介绍了不同类型脂肪酶在DHA、EPA 分离纯化中的作用和应用，结合实例分析了酶工程技术在酶法扩大化生产DHA、EPA 的应用，以期为酶法生产DHA、EPA 的工业化生产提供参考。

1 脂肪酶的分类与应用

酶催化反应是一个比较温和的过程，可以保证DHA 和EPA 的结构稳定，同时催化又具有高度选择性，这使得酶法在富集DHA 和EPA 方面有明显优势。Bottino 等[32]研究表明，脂肪酶对酰基碳链的选择性与鱼油中n-3PUFA 对脂肪酶水解的“抵抗效应”有关。不饱和脂肪酸分子中存在碳碳双键和全顺式构型，这样的分子结构会引起整个碳链的弯曲，因此在油酯分子上不饱和脂肪酸靠近酯键的最末端甲基对脂肪酶的“进攻”形成了空间阻碍。DHA 和EPA 分子中分别有6 个和5 个双键，导致全顺式构型的整个链高度弯曲，加强了这种空间阻碍作用，使得脂肪酶难以接触到DHA和EPA 形成的酯键，故脂肪酶对DHA 和EPA 酰基作用较弱，不同脂肪酸在甘油酯中的构型见图2。饱和与单不饱和脂肪酸在空间上对酶分子不存在这样的空间阻碍，因而很容易被水解。酶法制备DHA 和EPA 的原理就是利用脂肪酶的这一特性[33]。目前，酶法制备DHA 和EPA 主要有选择性水解反应、选择性转酯反应和选择性酯化反应等。无论何种方式，都需要运用酶的选择性来完成，依据其在反应过程中的作用不同可以分成三大类：DHA 专一性酶、EPA 专一性酶以及DHA、EPA 专一性酶。

图2 不同脂肪酸在甘油酯中的构型[57]Fig.2 Configurations of different fatty acids in glycerides[57]

1.1 DHA 专一性酶

DHA 专一性酶是一种对DHA 具有选择性，对除了DHA 以外的PUFA 及饱和、单不饱和脂肪酸没有选择性的脂肪酶，这类脂肪酶较为常见，多数脂肪酶都具有这种特性[34]。利用这种酶可以富集DHA，而富集其它脂肪酸的效果较差，比较典型的有褶皱假丝酵母脂肪酶，戴尔根霉（Rhizopus delemar）脂肪酶，黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶，青霉菌（Penicillium camembertii）脂肪酶等。Halldorsson 等[35]研究了12 种商业脂肪酶在鱼油醇解反应中的催化特性，得出大多数脂肪酶对饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸都具有较强的催化作用，而对n-3PUFA 具有对抗性的结论。就DHA 和EPA 来讲，这些脂肪酶通常更倾向水解EPA，由于在DHA 结构中，碳碳双键与羧基之间的距离要比EPA 近得多，如图3所示。这增加了脂肪酶对DHA 作用的难度[36]。因此大多数脂肪酶都具有DHA 选择性。Tannka 等[37]尝试利用脂肪酶对鱼油进行选择性水解，从而将鱼油DHA 富集在甘油酯中。他们发现在褶皱假丝酵母脂肪酶的水解作用下，甘油酯中的DHA 含量一直处于上升状态，而EPA 含量先增加后减少，最后含量比原来鱼油中的含量还低。产生这种现象的原因是褶皱假丝酵脂肪酶是一种对脂肪酸碳链有选择性的酶，在催化中优先水解饱和或单不饱和脂肪酸，使得n-3PUFA 的含量均有上升，水解到一定程度后，褶皱假丝酵母开始作用于n-3PUFA，由于该酶对EPA的水解作用更强一些，因此EPA 含量下降，而DHA 的含量一直在上升。Shimada 等[38]以金枪鱼油在NaOH 乙醇体系中水解后得到的游离脂肪酸混合物作为反应底物，在戴尔根霉脂肪酶的催化下使饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸与月桂醇选择性酯化，反应结束后，DHA 的收率达到84%，将未反应的脂肪酸萃取后再进行一次选择性酯化，DHA 的纯度可达89%，收率为71%。Seung 等[39]在实验室规模填充床中进行了DHA 的连续富集反应。首先使金枪鱼与NaOH 发生皂化反应，再做酸化处理，然后用正己烷萃取出上层油相中的脂肪酸，进一步用具有高度选择性的戴尔根霉脂肪酶催化脂肪酸与乙醇发生酯化反应。研究发现随着反应底物在填充床中停留时间的延长，DHA 的浓度逐渐上升，其回收率逐渐下降。产生这种现象的原因是戴尔根霉脂肪酶是一种DHA 选择性酶，随着反应的进行，其它脂肪酸比DHA 更容易发生酯化反应，使得游离脂肪酸中的DHA 得以富集。条件优化的结果为：20 ℃，醇酸比5 ∶1，水含量1%的体系中，反应时间为90 min，产物中DHA 浓度达到70%，回收率达87%。DHA 专一性酶种类相对较多，且专一性强，大部分水产中的DHA 含量要高于EPA 含量，因此，利用DHA 专一性酶从水产及加工废物中富集DHA 是制备DHA 产品的一条非常具有前景的途径。

图3 甘油酯中EPA 与DHA 空间结构对比（省去碳链氢原子）[57]Fig.3 Comparison of EPA and DHA structures in glyceride （Hydrogen atoms on the carbon chain are not shown）[57]

1.2 EPA 专一性酶

EPA 专一性酶是指那些对EPA 具有选择性，对其它脂肪酸选择性不强的酶，主要是一些米赫毛霉（Mucor meihei）脂肪酶和假单胞菌（Pseudomonas）脂肪酶，这种脂肪酶可以用来富集EPA。脂肪酶的作用位点在分子的酯键上，因此脂肪酶需要与酯键结合才能起到催化作用，而DHA 的碳链甲基端离酯键的距离更近，从而更容易阻挡酶与酯键的结合，所以大多数脂肪酶更容易催化EPA。因此，具有EPA 专一性的脂肪酶通常比较少见。Yamane 等[40]用游离的n-3PUFA 和n-3PUFA甲酯与富含n-3PUFA 的鱼肝油在固定化酶米赫毛霉脂肪酶的催化下进行转酯化反应，研究发现当单独使用EPA 时，富集在鱼肝油中的EPA 含量可达57%，而如果使用EPA 和DHA 的混合物，鱼肝油中的EPA 含量在5 h 后开始下降，而DHA的含量上升。后续研究表明出现这样现象的原因是由于鱼油中EPA 被DHA 所取代而达到了一个新的平衡。利用酶的这种特性，可以从混合酯中分离制备EPA。Fajardo 等[41]利用商业化的米赫毛霉脂肪酶催化棕榈油与n-3PUFA 反应，并且使用正己烷作为反应体系，反应24 h 后，产物中含有20.8%的EPA 和15.6%的DHA，相对于原料而言，EPA 含量明显增加而DHA 含量的增加不明显。Haraldsson 等[42]对比了17 种脂肪酶催化乙醇与含有n-3PUFA 的甘油酯进行转酯化反应，发现假单胞菌脂肪酶对饱和及单不饱和脂肪酸的催化活性高，可以同时富集DHA 和EPA。进一步的研究还发现，在假单胞菌脂肪酶所催化的酯交换反应中，DHA 比EPA 的反应要更快一些，这是一种比较少见的情况。随后[35]又做了12 种脂肪酶富集沙丁鱼油中PUFA 的研究，研究发现洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）脂肪酶，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）脂肪酶这两种脂肪酶更容易水解DHA 形成的酯，其它来源的脂肪酶更容易水解EPA 形成的酯。总之，EPA 专一性酶的研究比较少见，并且相关的作用机理还不明确，值得进一步开发与研究。

1.3 DHA、EPA 专一性酶

DHA、EPA 专一性酶是指那些对饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸没有选择性，对EPA 和DHA有选择性的酶，这类酶可以同时富集DHA 和EPA，然而对DHA 和EPA 的分离效果较差，主要有白地霉（Geotrichum candidum）脂肪酶，南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶，绵毛嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosa）脂肪酶等[43]。Shimada等[44]研究结果表明，在白地霉脂肪酶的催化作用下，金枪鱼油中的n-3PUFA （主要是DHA 和EPA）会富集在甘油酯中，而且水解结束后产物主要是甘油三酯。金枪鱼油在温度为30 ℃，酶解时间为16 h 的条件下，水解度为33.5%，水解产物中含有48.7%的EPA 和DHA 甘油酯；经过第2 步水解，DHA、EPA 甘油酯的含量提高到57.5%，得率为54.5%，回收率为81.5%。进一步研究发现，白地霉脂肪酶富集甘油三酯型DHA、EPA 的机制主要是通过催化偏甘油酯（甘油单酯、甘油二酯）与n-3 发生缩合反应以及偏甘油酯之间的酰基转移反应来实现。南极假丝酵母脂肪酶是一种来源于南极假丝酵母的脂肪酶，已经被广泛地用于工业生产，并且有成型的工业产品。Novozym 435 就是将来自南极假丝酵母脂肪酶固定于大孔吸附树脂上的脂肪酶，主要用于酯化法合成油酯的研究。Cerdan 等[45]采用Novozym 435 在正己烷体系催化DHA、EPA 与甘油的酯化反应，在优化后的反应条件下，产物中甘油酯的含量达到84.4%，且甘油三酯中主要成分是DHA 和EPA。陈小娥等[46]以游离DHA 和EPA 与甘油发生酯化反应制备PUFA 甘油三酯，考察了合成的影响因素。结果表明，正己烷6 mL，甘油/EPA（DHA）摩尔比为1 ∶3，Novozym 435 添加量为100 mg，反应温度为40 ℃，振荡频率150 r/min，反应24 h 后加1 g 分子筛，反应时间48 h，EPA 甘油三酯和DHA 甘油三酯的得率分别可达到88.64%。全文琴[47]利用粗鱼油进行化学水解，制备出高纯度的游离脂肪酸，通过C18 柱将DHA 和EPA 分离，最后将纯化的DHA 和EPA 与甘油混合，在Novozym 435 催化下得到纯度较高的甘油酯型DHA 和EPA。Lei 等[48]对比了米氏根霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶，绵毛嗜热丝孢菌脂肪酶和Novozyme 435 脂肪酶在富集n-PUFA时的特性。对于水分来讲，Novozyme 435 在较干燥的条件下（2%水分含量）表现较好，然而绵毛嗜热丝孢菌脂肪酶和米氏根霉脂肪酶需要较高的水分含量（3%，4%）；真空适合于Novozyme 435，氮吹适用于另外两种酶的后续研究；就温度而言，Novozyme 435 和米氏根霉脂肪酶的富集效果随着温度的升高，增加不明显，并且在40 ℃和50 ℃附近的富集效果较差，绵毛嗜热丝孢菌脂肪酶可以耐受较高的温度，并且在40～60 ℃范围内富集效果最好。综合考虑绵毛嗜热丝孢菌脂肪酶具有较好的富集效果。此外，绵毛嗜热丝孢菌脂肪酶催化的酯交换反应（40 ℃，2.5 h，氮吹）可以将n-3PUFA 转化成TAG，具有较高的融点。得到的产物中主要为DHA 和EPA。Solaesa 等[49]通过Novozyme 435 对沙丁鱼进行酶促甘油解反应来制备甘油酯混合物，随后进行逐步蒸馏来进一步富集甘油酯混合物中的DHA 和EPA。短程蒸馏在UIC KDL 5 系统（真空为10-3mbar，供料流量为1 mL/min）中进行，第1 次蒸馏在蒸馏温度为110℃的条件下，目的是彻底除去甘油和大部分的游离脂肪酸；第2 步蒸馏温度为155 ℃；馏出物的纯度为91%，回收率为94%。得到的产物的主要成分是DHA 和EPA 的甘油酯。

2 固定化酶技术的应用及扩大试验

酶工程技术特别是固定化酶技术的发展大大降低酶法生产高纯度DHA、EPA 的成本，发酵罐培养技术的进一步发展为酶法生产DHA、EPA 的工业化提供了技术支持。固定化酶与一般水溶性酶相比，以固相状态作用于底物，这样不仅保留了酶原有的优点，而且反应后酶易与反应液分离，有利于产物的进一步分离纯化。脂肪酶通过与油层界面的接触不能够充分发挥它的作用，因为油不能渗透到催化剂的多孔构造中，有机助溶剂虽然可以促进酶与油的接触，但同时有机助溶剂也可以促进酶从疏水性载体上的解吸附。解决问题的方法一般是通过在脂肪酶表面添加多孔渗水的疏水载体，因为这样可以促进界面活化，提高酶的催化效率[50-51]。脂肪酶经固定化处理后，稳定性提高，催化效率提高，机械强度增加。Fernández-Lorente等[52]通交联的方法使米氏根霉脂肪酶与多官能团的高聚物（醛葡聚糖）结合，通过优化交联条件，吸附酶的解析大大降低。在有机助溶剂和洗涤剂冲洗后，超过95%的交联固定化酶米氏根霉脂肪酶仍然吸附在载体上。这种新的、固定化的米氏根霉脂肪酶有效地促进了DHA、EPA 的富集，并且在反应过程中很稳定。固定化酶的半衰期大大延长。胡隼等[53]采用吸附法将酵母脂肪酶固定在特殊的酶布上，对比了固定化酶与传统商业酶在催化反应上的不同。发现固定化使酶与底物充分接触，增加了酶促反应的效率，降低了反应过程中酶的用量，并且提高了产物中DHA、EPA 的含量。印度学者Aarthy[54]利用PDA 培养基在4 ℃培养酵母菌株，利用菌株产生隐球酵母脂肪酶对沙丁鱼油中的DHA、EPA 进行富集。试验先是在实验室小规模操作，之后利用固定化酶技术结合发酵罐培养技术进行扩大试验。扩大试验是在一个3.7 L 的发酵罐培养，搅拌器转速为300 r/min，气流速度为1 m3/min，温度为25 ℃，培养时间72 h，此条件下，最大的酶活力是（60±2）U/mL，生产效率为0.8 U/mL/h，酶活生产力是摇瓶培养条件下的1.6 倍。浓缩的酶可以有效水解沙丁鱼油，产物中DHA、EPA的含量是最初原料的1.8 和2.6 倍。Kahveci 等[55]利用褶皱假丝酵母脂肪酶对沙丁鱼加工废弃物中的DHA、EPA 进行富集。通过多步水解使n-3PUFA 在废弃物油中的含量增加量超过了300%，并且反复水解后EPA 和DHA 的回收率只出现轻微下降。反应被放大到中型搅拌釜反应器中，在最优条件下，产物中的DHA 和EPA 的含量超过了50%，是原料的4 倍，这种方法适合于大规模生产，因为上一步反应产物纯化后可以重新循环到反应器中，不经任何附加处理。Wang 等[56]以高酸度的鱼油为原料，利用商业化的固定化酶Novozym 435 制备高纯度的n-3PUFA 甘油酯。这个工艺包括粗鱼油的脱酸，碱法合成PUFA 乙酯，浓缩PUFA 乙酯，酶法催化合成PUFA 甘油酯，合成的甘油酯含有5.5%的EPA 和74.6%的DHA，是初始鱼油的1.21 倍和2.71 倍。该试验成功地被放大了100 倍，证明可行，为酶法生产DHA、EPA的产业化提供了重要参考。

3 展望

酶法生产DHA、EPA 具有能耗低，反应条件温和等特点，产物具有良好的感官特征。通常情况下，利用一种类型的脂肪酶很难达到预定的分离和纯化效果。因此，在制备DHA、EPA 的过程中，利用不同类型酶的特性不同，实现协同效应，对于实际生产至关重要[57]。Yuji 等[58]采用两步酶解法将多元不饱和脂肪酸富集在游离脂肪酸中，先筛选出一种对n-3PUFA 水解效果与其它脂肪酸水解效果相差不大的酶，对富含n-3PUFA 的油脂进行水解，再进行选择性酯化。在第1 步水解过程中采用酶法水解，从而避免了热碱法带来的PUFA 异构化及废水排放等问题，利用假单胞菌脂肪酶对油脂中的DHA 和EPA 进行水解；第2 步酯化反应过程中，以月桂醇为反应溶剂，以米氏根霉脂肪酶为催化剂，使除DHA 以外的脂肪酸优先被酯化，得到游离脂肪酸中的DHA 含量提升到71.6%，进一步用正己烷对游离脂肪酸进行萃取，再次进行选择酯化，制得浓度为91%的DHA 样品。Breivik 等[59]将脂肪酶法与化学法相结合分离DHA 和EPA，首先将鱼油经过假单胞菌脂肪酶催化乙醇解，使DHA 和EPA 富集在甘油酯上，经过一次短程蒸馏，n-3PUFA 的含量在40%～50%，收率达88%。然后利用米赫毛霉脂肪酶的选择性乙醇解，使EPA 以EPA 乙酯的形式富集，而DHA 仍在甘油酯上，再一次短程蒸馏将甘油酯与乙酯分离，富含DHA 的甘油酯在南极假丝酵母脂肪酶的催化下进一步乙醇解，得到富集的DHA 乙酯，工艺见图4。脂肪酶法富集DHA、EPA 具有选择性强，反应条件温和，产品质量稳定等优点，因此在未来工业应用中有比较明显的优势。由于目前的研究工作尚不完善，对部分酶的作用机理还不明确，需要对系统做更深入的研究。此外，酶法富集DHA、EPA 应用于工业的瓶颈主要在于脂肪酶的成本较高，所以通过酶工程技术来提高酶的回用次数，开发新的酶资源，降低单位产品的原料成本值得深入研究。