多波长高效液相色谱法测定食用植物油中4种迷迭香提取物

韩焕美 张爱霞 郑新华 陈 晞 何桂华

（济南出入境检验检疫局 山东济南 250014）

1 前言

迷迭香提取物（Rosemary Extract）含有鼠尾草酸、迷迭香酚、迷迭香酸、熊果酸、鼠尾草酚、表迷迭香酚、异迷迭香酚、迷迭香二酚等多种有效成分，可分为油溶性（抗氧化剂）和水溶性（抗氧化剂及防腐剂）2种，前者有效成分主要为鼠尾草酸，后者主要为迷迭香酚[1]。迷迭香提取物天然无毒，抗氧化功效远远高于现有的维生素C、维生素E、茶多酚等天然抗氧化剂，是人工合成抗氧化剂 BHA、BHT 的 2～4 倍，且其结构稳定、不易分解，可耐190～240℃高温，彻底克服了维生素C、茶多酚等大多数天然抗氧化剂遇高温分解这一致命弱点[2]。故相比其他同类产品，它具有更高效广谱的优势。研究者发现，迷迭香提取物在300 mg/kg 时，其抗氧化活性相当于200 mg/kg BHA，大于 100 mg/kg 维生素 E[3，4]。迷迭香提取物和茶多酚提取物在食用油脂中的应用前景广泛，但检测方法还不成熟，本文旨在建立其相应的检测方法。

2 实验部分

2.1 试剂材料与仪器设备

乙腈，色谱纯，默克化工技术有限公司；冰乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；鼠尾草酸高纯试剂，纯度为95%； 鼠尾草酚高纯试剂，纯度为98%；熊果酸高纯试剂，纯度为98%；迷迭香酸高纯试剂，纯度为97%，均购于南京春秋生物工程有限公司； 水，Milli-Q 超纯水系统制备；Agilent1260 series液相色谱仪，配有FLD 和DAD 检测器，美国安捷伦公司；分析天平（感量为0.1 mg），梅特勒-托利多公司；Milli-Q 纯水器，美国 Millipore 公司；IKA-KS130型振荡器，德国 IK 公司； 色谱柱，Waters XTerra RP-C18（250×4.6 mm，5 μm）。油样橄榄油、大豆油、花生油等，均购于超市。

2.2 对照品溶液配制

熊果酸对照品溶液：称取熊果酸粉剂0.102 g，加入甲醇+水（1+1，V/V）约 2 mL，然后加入约 0.5 mL氢氧化钠（20 g/L）溶液，搅拌、震荡使其完全溶解，然后用甲醇+水（1+1，V/V）定容至 10 mL，浓度为1 mg/mL[5]；迷迭香酸对照品溶液：称取粉剂0.2577 g，置 50 mL 容量瓶中,加乙腈、甲醇+乙酸（9+1，V/V）适量使其溶解,再加乙腈稀释至50 mL,摇匀，浓度为5.0 mg/mL；鼠尾草酸对照品溶液：称取鼠尾草酸粉剂0.0105 g，置10 mL 容量瓶中,加乙腈、甲醇+乙酸（9+1，V/V）适量使其溶解,再加乙腈稀释至10 mL,摇匀，浓度为1.0 mg/mL；鼠尾草酚对照品溶液：称取鼠尾草酚粉剂0.0202 g，置10 mL 容量瓶中,加乙腈、甲醇+乙酸(9+1，V/V)适量使其溶解,再加乙腈稀释至10 mL,摇匀，浓度为2.0 mg/mL[6]。

2.3 标准工作曲线的建立

系列混合标准工作溶液：精确移取适量的上述标准溶液于10 mL 容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀。制成质量浓度均分别为 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 的混合标准溶液系列。在设定色谱条件下,分别取10 μL进行HPLC 分析。以标准系列质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

2.4 液相色谱分离条件

流动相：A，乙腈；B，H2O（含体积分数 4%的冰乙酸）；梯度洗脱见表1；流速: 0.8 mL/min；柱温: 40℃；检测波长为 210 nm、280 nm；进样体积：10 μl。

表1 HPLC梯度洗脱条件

2.5 油脂前处理及测定

精密称取样品约2.000 g，加入10 mL 正己烷溶解，然后用10 mL 饱和正己烷的乙腈萃取，振荡，超声25 min，离心后取乙腈层，定容至 10 mL，过 0.45 μm滤膜后上机检测。

3 结果与讨论

3.1 4种迷迭香提取物的标准曲线及线性

按照2.3 的方法绘制标准工作曲线，4种迷迭香提取物对照样品的液相色谱图见图1。空白样本中加入已知浓度混合对照品溶液，稀释至最低出峰浓度，取信噪比（S/N）=3（S、N 分别为信号和噪声的有效功率）时作为方法的定性检出限浓度，信噪比（S/N）=10 时作为方法的定量检出限浓度。然后根据加入空白样本质量、定容体积、检出限浓度计算出该方法的检出限，见表2。

图1 迷迭香提取物标准样品的液相色谱图

表2 4种迷迭香提取物对照品的线性方程

3.2 4种迷迭香提取在油脂中检测法研究

在4种提取物的分离分析过程中，影响因素很多，除色谱柱之外，流动相及流动梯度是关键。结合化合物结构和性质，初步选择乙腈、甲醇作为流动相中的有机相，水、乙酸水溶液、乙酸铵水溶液作为流动相中的水相。本文比较了乙酸水溶液+甲醇、水+甲醇、乙酸铵水溶液+甲醇、乙酸水溶液+乙腈、水+乙腈等几种流动相。实验过程中发现，1%乙酸水溶液+甲醇作为流动相时，不管如何调整洗脱梯度，各化合物的吸收峰都不够尖锐，跨度较大，不利于定量； 水溶液+甲醇、0.4%乙酸水溶液+甲醇这2类流动相也有类似的问题；2%乙酸铵水溶液+甲醇作为流动相时，鼠尾草酸保留时间小于2.5 min，而熊果酸的保留时间大于15 min，这说明乙酸铵水溶液的极性太大，因此，可以确定，乙酸铵水溶液和甲醇不适合作为此方法的流动相。所以，在接下来的实验过程中，多以乙酸水溶液+乙腈作为该方法的流动相。

首先选择了1%乙酸水溶液+乙腈作为流动相，峰型尖锐对称，但是鼠尾草酸的保留时间不合适；又选择水+乙腈作为流动相，峰型尖锐对称，鼠尾草酸和迷迭香酸分离度不够。结合1%乙酸水溶液+乙腈、水+乙腈2种流动相的优势，最后选择0.4%乙酸水溶液+乙腈作为试验的流动相，采取了梯度洗脱，以减少分析时间和提高分离效率，为了更好地控制各化合物的保留时间，又稍稍降低了流速，定为 0.8 mL/min。

在方法的优化过程中，选择多波长同时检测，检测波长选择了4 个，分别为210 nm、251 nm、280 nm、460 nm，同时采集210～640 nm 的光谱；流动相和梯度洗脱条件确定后，分析各化合物的吸收光谱图，见图2。不难看出，4种化合物的 λmax（最大吸收波长）各异，鼠尾草酸：λmax=216 nm；迷迭香酸：λmax=220 nm；鼠尾草酚：λmax=231 nm；熊果酸：λmax=210 nm。但是鼠尾草酸、迷迭香酸、鼠尾草酚的光谱图显示其在260～360 nm 有完整的吸收峰。多波长同时检测能选择各个化合物的最佳吸收波长，能有效提高目标化合物的检测灵敏度[7]，但是，其定性定量谱图则显得比较凌乱，经过综合考虑选择280 nm 作为3种化合物的检测波长，210 nm 则为熊果酸的检测波长。由图1和图2可知，各形态完全基线分离，峰型对称、尖锐，满足检测需要，但是鼠尾草酸和迷迭香酸的分离仍需进一步调整色谱条件。

图2 4种迷迭香提取物对照品的液相色谱图和光谱图

3.3 4种迷迭香提取在油脂中提取方法研究

4种迷迭香提取物均为极性相对较强的化合物，含有脂溶性物质，因此在提取液的选择上以甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂作为提取溶液。超声波可产生高速强力的物理作用，能提高溶解效率。超声萃取具有耗时短、样品无交叉污染的特点，适合大批量样品的测定[8]。因此，依据文献及化合物本身的结构性质分析，本着简单便捷、减少交叉污染的原则，选择了有机溶剂-超声提取方式，提取溶剂则选择了与流动相较为一致的试剂。

首先固定超声时间15 min，选择最优的提取溶剂。准确称取2 g 油脂样本，加入10 mL 正己烷溶解，然后用10 mL 甲醇萃取2 次，合并萃取液，氮吹浓缩，然后用甲醇定容至10 mL，然后过滤膜上机检测，发现4种化合物的回收率都不高，为59.4%～77.3%。采用同样的方法，发现乙醇溶液作为提取溶剂，回收率为66.7%～75.6%； 乙腈溶液作为提取溶剂，回收率为76.1%～88.6%； 乙酸乙酯作为提取溶剂，回收率为71.2%～80.6%。可见，乙腈作为提取溶剂有利于更好地提取油脂中的目标产物，因此，先将正己烷和乙腈按照体积分数1∶5 的比例混溶，待静止后分层，可得到饱和正己烷的乙腈溶液，然后按照上述方法提取油脂中的目标产物，回收率为72.4%～90.6%，满足检测需求。为了提高提取效率和简化提取步骤，采用饱和正己烷的乙腈提取时，适当增加混匀次数，萃取液定容至10 mL，然后在过滤膜上机检测，发现回收率为70.4%～89.9%，并没有显著下降，因此，提取溶剂最终选择饱和正己烷的乙腈溶液。

在减少萃取次数的前提下，增加震荡时间使得加标回收率并没有明显降低，因此，又优化了超声时间。不同超声时间下，4种化合物的加标回收趋势见图3。从图3明显看出，虽然个别化合物回收率在不同的时间段有显著差异，但是，随着超声时间的延长，回收率逐渐升高，25 min 或 30 min 以后，变化甚微，因此，最终选择超声时间为25 min。

图3 4种迷迭香提取物对照品的加标回收和超声时间关系

实验表明，“样品经正己烷溶解，然后用饱和正己烷的乙腈溶液萃取，振荡，超声25 min，离心后取乙腈层，定容，过0.45 μm 滤膜后上机检测”，该过程简单便捷，交叉污染小，提取效率高，加标回收色谱图见图4。图4中，sam、add 分别为空白样本、加标样本 2 μg/mL。从图4上不难看出：4种化合物分离度良好，回收率不是特别良好，计算回收率均为80.6%～91.3%，这可能与提取溶剂的选择有关，还需要进一步研究。

图4 橄榄油中添加4种迷迭香提取物标准样品/对照品的加标回收液相色谱图

为了验证该方法在检测植物油中4种迷迭香提取物的通用性，实验室选择了橄榄油、大豆油、花生油、调和油等4种植物油脂。每种油脂准确称取约2.0 g 样本 12份，每 6份为一组，分别添加 1.0 μg/mL和2.0 μg/mL 的4种对照品，然后按照上述提取过程提取后上机检测，依据线性方程可得对应化合物的浓度，最后计算可得回收率，见表3。

表3 迷迭香提取物对照品加标浓度和回收率

（续表3）

4 结语

抗氧化剂的添加有利于降低油脂的过氧化值，抑制油脂的氧化。但是，各类抗氧化剂的保鲜效果与添加量有直接关系。据文献报道和文章研究发现，迷迭香提取物在高温和低温条件下均表现出显著的抗氧化性，有良好的生物安全性[9-11]，可以说,迷迭香提取物是最佳的油脂类抗氧化剂。

GB 2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》中规定,迷迭香提取物在食用植物油中添加限量是0.7 g/kg。本文通过优化流动相、检测波长、提取溶剂和提取时间等，最终建立了4种迷迭香提取物的检测方法，能有效地检测食用植物油添加的4种迷迭香提取物，经加标回收实验证实，其分离度好，对照品吸收峰型尖锐对称，4种油脂中加标回收率为80.6%～91.3%。