硒酸钠与牛血清白蛋白相互作用的机理分析

韩晓乐，李擎宇，郝 浩，刘晨音，雷佳文，于 帆,胡军成

(中南民族大学化学与材料科学学院，湖北 武汉,430074)

硒酸钠(Na2SeO4，别名无水硒酸钠)是自然界中硒的主要无机化合物之一，主要被用于癌症的治疗[8-13]。临床试验证明硒是可以作为很多癌症化学疗法的药剂[14]。虽然大量实验表明硒对癌有抑制作用，但其抑制机理并不十分清楚。具有重要应用前景的微量元素硒与生物大分子相互作用的报道也较少。随着微量元素硒在生命科学中的广泛应用，考虑到其抗癌药物的活性与重要的医用价值，研究其与牛血清白蛋白的相互作用显得非常有意义,为此，本文在模拟动物体生理条件下, 采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱等方法研究不同温度下硒酸钠与牛血清白蛋白的相互作用，并通过计算二者相互作用时的热力学参数及检测硒酸钠对牛血清白蛋白构象的影响，对其相互作用机理进行分析，以期为微量元素硒在生命科学中的应用提供参考。

1 试验

1.1 仪器与试剂

带恒温系统的LS55荧光光度计(美国Perkinelmer公司)、TU-1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；牛血清白蛋白(BSA)、Na2SeO4、Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)、浓HCl,以上试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水。

1.2 溶液配制

配制浓度为0.05 mol/L、pH = 7.4的Tris-HCl缓冲溶液：称量6.057 g三羟甲基氨基甲烷置于l L烧杯中，加入约800 mL去离子水，使其充分溶解后，用盐酸调节溶液pH=7.4。将溶液定容至1 L，高温高压灭菌后，放置于4 ℃冰箱中保存备用。

配制浓度为5.0×10-6mol/L的 BSA溶液:称量6.800 g的BSA，加入至20 mL新制的Tris-HCl缓冲液中，使其溶解消泡后，转移保存于4 ℃冰箱中备用。

配制浓度为1.0×10-3mol/L 的Na2SeO4溶液：称取0.944 mg的Na2SeO4，加入至3 mL去离子水中，充分溶解后，将溶液定容至5 mL备用。

配制BSA-Na2SeO4体系溶液：在298、304、310 K温度下，取3 mL浓度为5.0×10-6mol/L的BSA溶液于比色皿中，然后分别取3 μL浓度为1.0×10-3mol/L 的Na2SeO4溶液对BSA溶液进行连续滴定，配制BSA-Na2SeO4体系溶液，其中Na2SeO4的滴定终态浓度分别为：0、1.67×10-6、3.33×10-6、5.00×10-6、6.67×10-6、8.33×10-6、10.00×10-6、11.67×10-6mol/L。

1.3 表征

荧光光谱：选定激发狭缝宽度和发射狭缝宽度分别为10.0、5.0 nm，在激发波长为280 nm下测定Na2SeO4-BSA体系在298、304、310 K温度下的荧光光谱。

中国共产党在山东抗日根据地的文化动员工作一直以宣传抗日政策，提高民众文化素质为主要方向，各级党组织致力于揭露日伪的罪行和奴化教育的真实面目，打击和驳斥妥协投降的亡国谬论，发展各级学校教育，提高民众文化素质和政治觉悟，坚定广大军民的抗战决心，配合根据地各项工作的开展。这些工作为抗战胜利和新民主主义文化的发展产生了重要作用。

紫外-可见吸收光谱：测定在温度为298 K、pH=7.4的条件下所配制的不同浓度的Na2SeO4-BSA体系溶液的紫外-可见吸收光谱。

三维荧光光谱：在激发波长为200 nm、扫描波长为290～480 nm范围内，测定Na2SeO4-BSA体系的三维荧光光谱，扫描圈数为31。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Na2SeO4对BSA荧光光谱的影响

在温度为 298 K下，不同浓度的Na2SeO4对BSA荧光光谱的影响如图1所示。从图1中可以看出，在一定浓度范围内，Na2SeO4对BSA的荧光能产生猝灭效应，且随着Na2SeO4浓度逐渐增大，BSA荧光强度发生有规律的猝灭， 其最大发射波长从343 nm 红移至352 nm,表明BSA与Na2SeO4发生了相互作用，BSA的发色团微环境发生了改变，使色氨酸(Trp)残基更加裸露，即色氨酸所处环境的疏水性减弱，极性增强。

图1 不同浓度的Na2SeO4对BSA荧光光谱的影响

Fig.1 Effects of different concentrations of Na2SeO4on fluorescence spectra of BSA

2.2 Na2SeO4与BSA相互作用的机制

荧光猝灭主要包含动态猝灭、静态猝灭、混合型猝灭等[15]。荧光体与猝灭剂分子间的相互作用可用Stern-Volmer方程[16]进行描述，即

(1)

式中：F0为未加入猝灭剂时BSA的荧光强度；F为加入猝灭剂Na2SeO4后BSA的荧光强度；[Q]为猝灭剂Na2SeO4的浓度, mol/L;Ksv为Stern-Volmer猝灭常数， L/mol。

不同温度下Na2SeO4猝灭BSA荧光的Stern-Volmer关系图如图2所示。从图2中可以看出，随着温度的升高，Stern-Volmer猝灭常数(Ksv)不断减小，由此表明，温度升高，猝灭剂Na2SeO4与BSA形成的复合物的稳定性降低，温度升高不利于猝灭过程的进行，进而推测Na2SeO4与BSA相互作用形成了某种特定结构的基态配合物，表明Na2SeO4对BSA荧光猝灭为静态荧光猝灭。

图2 不同温度下Na2SeO4猝灭BSA荧光的Stern-Volmer关系图

Fig.2 Stern-Volmer relationship of Na2SeO4quenching BSA fluorescence at different temperatures

静态荧光猝灭作用是指荧光体分子与荧光猝灭剂分子之间借助分子间力结合形成了具有一定结构的超分子配合物、从而导致荧光体荧光强度减弱的现象, 静态的猝灭数据可以用修正的Stern-Volmer方程[17]处理, 即

(2)

式中：fa为可被荧光猝灭剂接近的发色基团占总的发色基团的百分比；Ka为静态荧光猝灭过程中复合物的形成常数, L/mol，它反映了在静态猝灭过程中生物大分子与荧光猝灭剂分子的结合反应达到平衡时的量效关系。

不同温度下Na2SeO4猝灭BSA荧光修正的Stern-Volmer关系图如图3所示。从图3中可以看出，静态猝灭常数Ka随着温度的升高而增大，表明Na2SeO4对BSA的荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭,而符合静态猝灭机制，进一步验证了前面的推测， Na2SeO4与BSA相互作用引起荧光猝灭并形成了基态配合物。

图3 不同温度下Na2SeO4猝灭BSA荧光的修正的Stern-Volmer关系图

Fig.3ModifiedStern-VolmerrelationshipofNa2SeO4quen-ching BSA fluorescence at different temperatures

在温度为298 K、pH=7.4的条件下，不同浓度的Na2SeO4对BSA紫外-可见吸收光谱的影响如图4所示。从图4中可以看出，对加入不同浓度的Na2SeO4后的BSA与未加入Na2SeO4空白的BSA的紫外-可见吸收光谱进行比较，在吸收波长为280 nm附近，加入Na2SeO4后，BSA的紫外-可见吸收光谱发生了明显变化，且随着Na2SeO4浓度的增加，Na2SeO4-BSA体系的吸光度逐步增强，进一步表明Na2SeO4与BSA基态分子间发生作用是BSA荧光猝灭的根本原因。

图4 不同浓度的Na2SeO4对BSA紫外-可见吸收光谱的影响

Fig.4 Effects of Na2SeO4with different concentrations on uv-vis absorption spectra of BSA

2.3 Na2SeO4与BSA相互作用模式

对于静态猝灭过程，小分子与蛋白质等生物大分子之间的相互作用通常包括静电作用力、疏水力、氢键、范德华力和空间位阻排斥力等[18]。根据相互作用的热力学参数，可以近似地判断出生物活性小分子与生物大分子之间的主要作用力类型。利用Van’t Hoff方程可以计算Na2SeO4与BSA反应的焓变和熵变，进而得到不同温度下反应自由能变(ΔG)，即

(3)

式中：K为Na2SeO4与BSA的结合常数， L/mol；R为摩尔气体常数；ΔH为反应的标准焓变, kJ/mol;ΔS为反应的标准熵变, J/(mol·K);T为反应温度，K。

以lnK对1/T作图，由斜率和截距分别计算出焓变(ΔH)和熵变(ΔS),则不同温度下Na2SeO4与BSA之间的反应自由能变(ΔG)可表示为：

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

不同温度下Na2SeO4与BSA相互作用的热力学参数如表1所示。从表1中可以看出，ΔG<0, ΔH<0，ΔS>0，表明Na2SeO4与BSA之间的相互作用模式主要是以静电相互作用为主，且是一个自发的反应。

表1 不同温度下Na2SeO4与BSA相互作用的热力学参数

Table 1 Thermodynamic parameters of interaction between Na2SeO4and BSA at different temperatures

T/KΔH/kJ·mol-1ΔS/J·mol-1·K-1ΔG/kJ·mol-1298-78.2340.6-18.0304-78.2340.6-18.2310-78.2340.6-18.4

2.4 Na2SeO4与BSA间的结合平衡

根据小分子与大分子配位方程，将BSA的荧光强度与猝灭剂Na2SeO4的浓度关系由荧光物质与猝灭剂间的结合表达式[19]求出，即

(5)

式中：Kb为Na2SeO4与BSA的表观结合常数, L/mol；n为它们之间的结合位点数。

由式(5)求出不同温度下Na2SeO4与BSA作用的表观结合常数及结合位点数，列于表2。从表2中可以看出，随着温度的升高，表观结合常数(Kb)不断地减小，当接近人体体温(310 K)时，表观结合常数最小，表明在人体体温范围内，Na2SeO4与BSA结合较弱，其毒性应该也较弱，结合位点(n)约为1，表明BSA与Na2SeO4相互作用形成一个结合位点。

表2 不同温度下Na2SeO4与BSA作用的表观结合常数及结合位点

Table 2 Apparent binding constants and binding sites of Na2SeO4and BSA at different temperatures

T/KKb/104 L·mol-1nR22982.21.0230.9983041.71.0920.9983101.21.0810.995

2.5 Na2SeO4对BSA二级结构的影响

利用三维荧光光谱检测Na2SeO4与BSA发生相互作用后Na2SeO4对BSA二级结构的影响。BSA及Na2SeO4-BSA体系的三维荧光谱图如图5所示。从图5中可以看出，加入Na2SeO4后，BSA的瑞利散射峰起始位置无明显变化，但BSA荧光峰(峰1)强度略有减弱，其荧光强度从498.6减小至437.2，进一步表明Na2SeO4对BSA有荧光猝灭作用；同时BSA的荧光峰(峰1)的位置略有变化，发射峰位置从342 nm 蓝移至339 nm, 表明Na2SeO4对BSA的二级结构有一定的影响。

(a)BSA

(b)BSA-Na2SeO4体系

Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of BSA and BSA-Na2SeO4system

3 结论

(1)硒酸钠对牛血清白蛋白的荧光有猝灭效应，二者反应形成复合物，硒酸钠对牛血清白蛋白荧光猝灭的方式属于静态猝灭。

(2)硒酸钠与牛血清白蛋白主要靠静电相互作用力结合，且相互作用是自发进行的。

(3)硒酸钠与牛血清白蛋白的结合位点数约为1，它们之间可以形成一个结合位点。

(4)在较小的浓度下，硒酸钠对牛血清白蛋白的二级结构有一定的影响。